【摘要】：背景:心血管疾病,尤其是急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI),嚴重影響病人的生活質(zhì)量,是發(fā)達國家的首位死亡原因,也是發(fā)展中國家疾病負擔的主要原因之一。近年來有較多關(guān)于干細胞(Stem cell)移植對AMI有治療作用的研究,主要包括胚胎干細胞(Embryonic stem cell,ESC)、骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cell,MSC)以及誘導(dǎo)性多能干細胞(induced pluripotent stem cells,i PSC)等。這些研究表明,干細胞移植可以改善AMI的心臟功能,并可能對縮小梗死后面積、減少心肌梗死的死亡率和致殘率有一定的幫助。而其中,i PS細胞由于其具有類似ESC的全能性,卻沒有ESC的道德倫理爭議,而且因為它來源于體細胞,避免了機體的免疫排斥反應(yīng),因此應(yīng)用前景較為廣闊。自吞噬(autophagy)是一種通過降解細胞質(zhì)組件而自身進化的過程,以此來維持細胞的生存和組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)。最近研究表明,自噬既可以使干細胞維持相對的未分化狀態(tài),又可以促進其分化過程。那么,自吞噬在i PS細胞移植干預(yù)AMI的過程中究竟起到何種作用,它是否可以作為i PS細胞移植作用于AMI的機制之一,目前尚未有相關(guān)研究。目的:探討自吞噬在AMI豬模型進行i PSC移植后的可能作用,并進一步探討其可能的作用機制。方法:1、建立AMI豬模型:選擇幼年蘇中豬20頭,體重23.52±2.33 kg,隨機分為3組:Sham正常對照組4頭、磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered solution PBS)對照組8頭、i PSC移植組8頭。對PBS組和i PSC移植組均采用介入法球囊堵閉豬冠狀動脈的左前降支動脈(Left anterior descending artery,LAD),從而建立AMI模型。通過查心電圖、檢測血漿肌鈣蛋白以及進行左心室造影來驗證AMI動物模型構(gòu)建是否成功。2、i PS細胞移植:在建立AMI模型前提前培養(yǎng)足夠數(shù)量的豬源性i PS細胞。AMI模型建成后一周打開胸腔,對i PSC移植組幼豬隨機注射豬源性i PS細胞2ml(含2x107個細胞)于梗死區(qū)(infaction zone,IZ)及梗死周邊區(qū)(boder zone,BZ)心肌內(nèi),對PBS對照組幼豬以相同方法注射2ml PBS液體,而Sham正常組則僅置入導(dǎo)管及球囊,不封堵,一周后開胸,不進行任何干預(yù)措施后關(guān)胸。3、動物處死及標本的處理細胞移植后第七周處死動物,開胸取出心臟,將組織按梗死區(qū)IZ,梗死周圍區(qū)BZ以及遠離區(qū)RZ(remote zone)分別放入液氮中保存。進行TTC染色觀察梗死心肌與正常心肌外觀,HE染色觀察心肌組織病理學(xué)改變。Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Atg5、Beclin1以及Cx43、MMP9、ANP等。結(jié)果:1、通過心電圖改變及心室內(nèi)造影提示豬急性心肌梗死模型建立成功。2、心臟標本的TTC染色提示i PS組心肌梗死面積明顯小于PBS組(P=0.01);HE染色和Masson’Trichrom染色顯示,在PBS組,梗死區(qū)呈連續(xù)性大片狀纖維化,有較多炎性細胞浸潤,未見存活心肌細胞。i PS組梗死區(qū)纖維化和炎性細胞浸潤顯著減輕,存活心肌較多,纖維化呈散在分布。i PS細胞移植組梗死周圍區(qū)域纖維組織顯著低于PBS組(P0.05)。3、自吞噬標志物的檢測:PBS組梗死區(qū)IZ、梗死周圍區(qū)BZ相對于遠離區(qū)RZ,LC3、Atg5及Beclin1的表達均顯著增強;i PS組IZ相對于RZ的自噬表達明顯增強;i PS組梗死區(qū)的自噬表達較PBS組梗死區(qū)有明顯增強趨勢,p值=0.058。4、PBS組中,心肌細胞的Cx43表達量在IZ及BZ明顯低于RZ,其中,IZ與RZ相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);在i PS組中,心肌細胞的Cx43表達量在IZ及BZ亦明顯低于RZ,且有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);i PS組IZ的Cx43表達量較PBS組IZ有明顯增強趨勢(P0.05)。5、PBS組中,IZ與RZ相比,心肌細胞的MMP9的表達顯著增高,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);在i PS組中,心肌細胞的MMP9表達量在IZ及BZ卻較RZ為低,但并無統(tǒng)計學(xué)差異;i PS組IZ、BZ對比PBS組相同區(qū)域,MMP9的表達量均有顯著降低(P0.05)。6、PBS組中心肌細胞的ANP表達量在IZ及BZ均明顯高于RZ(P0.05);在i PS組中,心肌細胞的ANP表達量在IZ較BZ及RZ為低(P0.05);i PS組IZ對比PBS組IZ,ANP的表達量均有顯著降低(P0.05)。結(jié)論:1、i PS干預(yù)AMI的過程中,可以引起自吞噬的上調(diào);2、i PS可能通過自吞噬誘導(dǎo)心肌細胞Cx43的表達增加,從而可能對心臟電生理產(chǎn)生影響;3、i PS可能通過自吞噬誘導(dǎo)心肌細胞MMP9的表達減少,從而可能改善心肌重構(gòu);4、i PS細胞移植可以使心肌細胞內(nèi)ANP的表達下調(diào)是否與自噬調(diào)節(jié)有關(guān),有待進一步探索。
【圖文】：

式注入稀釋肝素 8000u，術(shù)中每隔 l 小時追加 2000u。2.1.3.7 左室造影及壓力測定： 接心電監(jiān)護儀以監(jiān)測心率及心律改變，術(shù)中給予低流量（3-5L/min）吸氧。經(jīng)右股動脈鞘管送 6F 指引導(dǎo)管至左心室行高壓注射造影。連接測壓儀，調(diào)零后分別測定左室壓力和主動脈壓力。2.1.3.8 封堵冠狀動脈 LAD： 經(jīng)鞘管逆行送入 Judkins Left 4.0 冠狀動脈造至冠狀動脈開口處行左冠狀動脈造影，每次注入 5-20ml 優(yōu)維顯造影劑 370影。 造影成功后，根據(jù)造影結(jié)果確定封堵位置。一般選 LAD 第一對角支以第二對角支以上，大約 LAD 中下 1/3 的位置為封堵位置。經(jīng)指引導(dǎo)管送入導(dǎo)絲的球囊導(dǎo)管（2.0mm×l5mm），接近指引導(dǎo)管開口時先送導(dǎo)絲至 LAD 遠再沿導(dǎo)絲送球囊導(dǎo)管至 LAD 封堵處，以 5-6 個大氣壓打開球囊，堵閉 LAD囊阻塞 90min 后撤掉大氣壓，血流通暢使前端的心肌得到血流灌注。球囊后往往容易出現(xiàn)再灌注心律失常，一般為室速、室顫，要在維持主動脈壓定的同時隨時做好靜推利多卡因、電除顫的準備[1]。球囊封堵前后見圖 1。

tachycardia， VT）、心室顫動（Ventricular fibrillation VF），盡管進行了電復(fù)治療， 仍未能搶救成功而在 90 分鐘內(nèi)死亡。故而，本研究總的死亡率為 25%值得注意的是一旦 iPS 細胞注入到心肌、關(guān)胸后，，沒有一只豬死亡。1.2 鑒定豬急性心肌梗死模型是否成功：本研究采用心電圖觀察 ST 段抬高情況利用造模前后左心室造影觀察室壁瘤形成、心室擴大情況來觀察經(jīng) LAD 封堵建急性心肌梗死模型的效果。1.2.1 ECG 顯示封堵 90 分鐘后，V1-V3 導(dǎo)聯(lián) ST 段明顯抬高（ >0.2mv），并病理性 Q 波形成（圖 2）。1.2.2 封堵前，左心室造影（ Left ventricular angiography, LVG）顯示左心室收協(xié)調(diào)一致，封堵 90 分鐘后，左心室造影提示左室擴大、室壁瘤形成、收縮不一致（圖 3）。以上結(jié)果表明：通過 LAD 封堵結(jié)扎成功建立了豬 AMI 模型。A B
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R542.22;R-332

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本文編號：2623080