本文關(guān)鍵詞：抗人CD25基因工程抗體和免疫毒素在畢赤酵母中的表達，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的和意義CD25表達于活化T細胞表面,靜息T細胞不表達,這為靶向治療以活化T細胞介導的疾病如T細胞淋巴瘤、自身免疫病、移植排斥反應等提供了科學依據(jù)。采用畢赤酵母表達系統(tǒng),以Daclizumab(人源化抗CD25單抗隆抗體)為基礎(chǔ),構(gòu)建重組表達載體pPICZalpha A-biscfv (Daclizumab)和pPICZalpha A-dmDT390-biscfv (Daclizumab),在重組畢赤酵母GS115菌株中誘導表達biscfv (Daclizumab)和dmDT390-biscfv (Daclizumab)重組蛋白,為淋巴瘤、急性排斥反應、自身免疫病等疾病提供新的藥物治療方案。研究方法合成目的基因及構(gòu)建表達載體：利用DNAWorks軟件,獲得具有互補末端的寡核苷酸引物,采用裝配PCR法,合成四條短的基因片段scfv (1)、scfv (2)、scfv (3)、 dmDT390并連接至pMD19-T載體,測序正確后,四條短的基因片段酶切拼接后最終連入畢赤酵母表達載體pPICZalpha A。采用畢赤酵母系統(tǒng)表達蛋白：線性化的表達載體通過氯化鋰轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS1 15,在含有博來霉素的YPDS平板中篩選陽性克隆子。采用BMGY培養(yǎng)基增殖培養(yǎng),BMMY培養(yǎng)基誘導蛋白表達。SDS-PAGE和Western blot:蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上,采用鼠抗組氨酸尾抗體作為一抗,辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體作為二抗,采用化學發(fā)光試劑盒觀察結(jié)果。蛋白純化：采用鎳柱純化蛋白,純化出的蛋白采用高效液相色譜儀(HPLC)進行分析。結(jié)果1.通過DNAWorks軟件設(shè)計出合成scfv (1)、scfv (2)、scfv (3)的24條寡核苷酸引物,以及合成dmDT390的44條寡核苷酸引物,通過裝配PCR將合成的基因片段連入pMD19-T載體,測序獲得插入正確基因片段的pMD19-scfv(1)、pMD19-scfv (2)、pMD19-scfv (3) 和 pMD19-dmDT390載體。pMD19-scfv (1)和pMD19-scfv(2)經(jīng)酶切拼接后最終連入pPICZalpha A載體形成了pPICZalpha A-biscfv表達載體；pMD 19-scfv(2)、pMD 19-scfv(3)和pMD19-dmDT390經(jīng)酶切拼接后最終連入pPICZalphaA載體形成了pPICZalpha A-dmDT390-biscfv表達載體。2.經(jīng)氯化鋰轉(zhuǎn)化法獲得了穩(wěn)定整合目的基因的畢赤酵母菌株。3.整合了biscfv目的基因的畢赤酵母菌,表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE(還原性)電泳分析,得到分子量約為55kd表達產(chǎn)物,western blot驗證含組氨酸尾,為目的蛋白。4.整合了dmDT390-biscfv目的基因的畢赤酵母菌,表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE(非還原性)電泳分析,得到分子量約為95kd表達產(chǎn)物,western blot驗證含組氨酸尾,為目的蛋白。5.經(jīng)鎳柱純化的蛋白經(jīng)高效液相色譜儀檢測純度大于99%。結(jié)論重組畢赤酵母GS115能穩(wěn)定表達biscfv和dmDT390-biscfv蛋白,蛋白經(jīng)鎳柱純化后能獲得高純度的蛋白。
【關(guān)鍵詞】：畢赤酵母 CD25 達利珠單抗 biscfv 白喉毒素
【學位授予單位】：福建中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392;Q78
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-12
• 第一章 材料和方法12-23
• 1 材料12-14
• 1.1 PCR引物,菌株,質(zhì)粒12
• 1.2 培養(yǎng)基12-13
• 1.3 試劑與溶液配制13-14
• 1.4 主要設(shè)備14
• 2 方法14-23
• 2.1 目的基因的合成及表達載體的構(gòu)建14-19
• 2.2 采用畢赤酵母體系表達biscfv和dmDT390-biscfv重組蛋白19-21
• 2.3 biscfv和dmDT390-biscfv蛋白純化21-23
• 第二章 實驗結(jié)果23-27
• 1 目的基因的合成和表達載體的構(gòu)建23-24
• 1.1 目的基因的合成23-24
• 1.2 表達載體的構(gòu)建24
• 2 采用畢赤酵母體系表達biscfv和dmDT390-biscfv重組蛋白24-26
• 2.1 biscfv蛋白24-25
• 2.2 dmDT390-biscfv蛋白25-26
• 3 蛋白純化26-27
• 3.1 biscfv蛋白純化26
• 3.2 dmDT390-biscfv蛋白純化26-27
• 第三章 討論27-30
• 1 目的基因合成及表達載體的構(gòu)建27-28
• 1.1 裝配PCR法27-28
• 1.2 構(gòu)建表達載體28
• 2 畢赤酵母體系表達biscfv和dmDT390-biscfv蛋白28-29
• 2.1 質(zhì)粒線性化28
• 2.2 蛋白表達28
• 2.3 SDS-PAGE和Western blot28-29
• 3 蛋白純化29-30
• 3.1 硫酸銨沉淀29
• 3.2 透析29
• 3.3 鎳柱純化29
• 3.4 超濾29-30
• 結(jié)論30-31
• 參考文獻31-33
• 附錄33-38
• 致謝38-39
• 文獻綜述39-46
• 參考文獻44-46
• 作者簡歷46

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 高新;宋海峰;林殿海;楊小盼;萬德友;陳樞青;;人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-免疫球蛋白G1 Fc融合蛋白在糖基工程化畢赤酵母中的表達[J];軍事醫(yī)學;2012年11期

  本文關(guān)鍵詞：抗人CD25基因工程抗體和免疫毒素在畢赤酵母中的表達，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：262360