本文關鍵詞：BMSCs對早產兒腦白質損傷模型腦內炎癥環(huán)境的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：觀察骨髓間充質干細胞(BMSCs)移植對早產兒腦白質損傷模型大鼠腦內腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)水平及活化小膠質細胞數量的影響,同時評估大鼠遠期神經行為功能。探討B(tài)MSCs修復早產兒腦白質損傷的可能機制。方法：1.取EGFP (enhanced green fluorescent protein, EGFP)轉基因大鼠的脛、股骨骨髓,采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)、純化BMSCs;熒光倒置顯微鏡下觀察干細胞形態(tài)；流式細胞儀分析細胞表型分子；CCK-8法繪制細胞生長曲線并與野生型BMSCs增殖情況相比較；分別向成脂、成骨、成軟骨誘導分化鑒定EGFP-BMSCs;2.將3日齡清潔級SD大鼠隨機分為三組：WMD模型組、BMSCs移植組和假手術組。WMD模型組和BMSCs移植組大鼠經異氟烷麻醉后予雙線結扎左側頸總動脈并吸入氧濃度為6%的氧氮混合氣體2 h,制作早產兒腦白質損傷模型。假手術組大鼠麻醉后僅游離左側頸總動脈,不做缺血缺氧處理。BMSCs移植組造模后經左側腦室定位注射EGFP-BMSCs懸液2 μl(含細胞2×105個),WMD模型組造模后經左側腦室定位注射2μlPBS,假手術組不予顱內注射；3.干預7d后,采用HE染色法觀察腦組織病理改變、免疫組織化學法檢測各組大鼠腦中ED-1陽性細胞數；干預7d、27d后,采用免疫熒光法檢測EGFP-BMSCs在大鼠腦部的定植情況；在分別干預6h、12 h、24 h、48 h、7 d后,采用ELISA和RT-PCR檢測各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β含量及mRNA的表達水平；4.隨訪觀察大鼠至術后27d后,稱量并記錄術前、術后24h、48h、7d、27d的實驗動的體重,并在術后27d進行動物神經行為學檢測評估各組大鼠的神經功能情況；5.統(tǒng)計學分析：采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行實驗數據統(tǒng)計分析。正態(tài)分布計量資料以x±s表示,組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗。兩樣本均數比較用t檢驗。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果：1.獲得穩(wěn)定表達EGFP的BMSCs,以長梭形為主,融合后呈漩渦狀排列；生長曲線示EGFP-BMSCs增殖能力旺盛,與野生型BMSCs比差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.023,P=0.982)；細胞CD29、CD90、CD34、CD49d、CD45表達率分別為99.4%、96.4%、0.171%、0.049%、0.038%；成脂、成骨、成軟骨誘導后,分別予以油紅O、茜素紅、甲苯胺藍染色,結果均呈陽性；2.干預7d后,HE染色結果顯示WMD模型組的大鼠腦白質區(qū)見部分細胞變性、壞死；BMSCs移植組的大鼠腦白質區(qū)未見明顯細胞水腫、變性和壞死；假手術組大鼠腦部未見明顯異常。免疫組織化學檢測結果顯示WMD模型組的大鼠腦內ED-1陽性細胞數明顯多于BMSCs移植組,假手術組明顯少于BMSCs移植組和WMD模型組(LSD檢驗,P值均0.05)。免疫熒光觀察顯示EGFP-BMSCs存活并定植于腦組織,但在干預27d后,腦內定植的細胞基本消失。干預6h、12 h、24 h、48 h和7d后,WMD模型組的大鼠腦內TNF-α、IL-1β蛋白水平均在24 h達到峰值,隨后呈下降趨勢,至7d時仍未降至正常水平；WMD模型組的大鼠在各時間點TNF-α、IL-1β蛋白表達水平顯著高于BMSCs移植組,假手術組TNF-α和IL-1p蛋白表達水平最低,差異均有統(tǒng)計學意義(LSD檢驗,P值均0.05)。干預24 h后,WMD模型組TNF-α和IL-1β mRNA表達水平高于BMSCs移植組,假手術組表達水平明顯低于BMSCs移植組和WMD模型組,差異均有統(tǒng)計學意義(LSD檢驗,P值均0.05)。3. BMSCs移植組大鼠遠期神經功能發(fā)育及動物體重較WMD模型組大鼠有所改善(LSD檢驗,P值均0.05)。結論：本實驗成功獲得高純度、穩(wěn)定表達EGFP的BMSCs,干細胞特性不受EGFP影響,細胞定植后,示蹤效果良好；3日齡幼大鼠予缺血缺氧處理造成的腦損傷符合早產兒腦白質損傷病理學改變。BMSCs移植可以有效改善大鼠神經功能恢復,其修復缺氧缺血導致的腦白質損傷可能與其抑制病變早期小膠質細胞激活,通過旁分泌機制下調炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達,進而減輕早期炎癥反應有關。
【關鍵詞】：早產兒 腦損傷 骨髓間充質干細胞 干細胞 炎癥因子 腦白質 小膠質細胞
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R742;R-332
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• ABSTRACT8-11
• 縮略詞(ABBREVIATION)11-13
• 前言13-15
• 第一章 綜述 間充質干細胞旁分泌效應在修復新生兒缺氧缺血性腦損傷中的應用15-22
• 第二章 材料與方法22-39
• 1. 實驗動物及分組22
• 2. 主要實驗儀器22-24
• 3. 主要實驗試劑24-26
• 4. 主要試劑配制26-27
• 5. 實驗方法27-39
• 第三章 實驗結果39-45
• 1. BMSCs體外分離、培養(yǎng)與鑒定39-40
• 2. 動物實驗結果40-45
• 第四章 討論45-50
• 1. BMSCS的培養(yǎng)及鑒定45-47
• 2. BMSCS移植對早產兒WMD模型腦內炎癥環(huán)境的影響47-48
• 3. BMSCS移植對早產兒WMD模型遠期神經行為學的影響48-50
• 第五章 結論50-51
• 第六章 問題與展望51-52
• 參考文獻52-59
• 附圖59-62
• 致謝62-63
• 作者簡介63

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