本文關(guān)鍵詞：siRNA沉默Bmi-1基因表達(dá)對(duì)K562細(xì)胞自噬的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:自噬是一種溶酶體的降解途徑,它廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)。一般情況下適度的自噬水平可以維持正常細(xì)胞的自我穩(wěn)態(tài),但是過(guò)高水平的自噬可引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的代謝紊亂而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生自噬性死亡。Bmi-1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1)基因是多梳基因(Polycomb Group genes,PcG)家族的重要成員之一。目前研究發(fā)現(xiàn),Bmi-1基因可參與到干細(xì)胞的增殖、分化以及衰老等過(guò)程,在很多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)擬選取慢性髓細(xì)胞白血病K562細(xì)胞作為研究對(duì)象,來(lái)探討B(tài)mi-1基因是否參與K562細(xì)胞株的自噬情況以及其可能的分子機(jī)制。方法:1、本實(shí)驗(yàn)選用慢性髓細(xì)胞白血病K562細(xì)胞作為研究對(duì)象。2、依照本實(shí)驗(yàn)室前期已設(shè)計(jì)好的五種siRNA質(zhì)粒序列:pGenesil-2-HK(陰性對(duì)照質(zhì)粒),pGenesil-2-Bmi-11,pGenesil-2-Bmi-12,pGenesil-2-Bmi-13和pGenesil-2-Bmi-14序列經(jīng)小干擾siRNA方法分別轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞,得到六種細(xì)胞:將未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞稱為K562-W,將轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒細(xì)胞稱作K562-V,將轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的細(xì)胞依次稱為K562-S1,K562-S2,K562-S3,K562-S4。3、Western blot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)不同的干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后Bmi-1蛋白和mRNA的表達(dá)情況。4、采用MTT實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)不同的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后在不同作用時(shí)間下對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響。5、采用透射電鏡掃描的方法檢測(cè)不同的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞前后細(xì)胞自噬的發(fā)生情況。6、采用western blot實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)不同的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞前后細(xì)胞中各種蛋白質(zhì)包括:Beclin1、LC3、Akt、p-Akt、mTOR、PTEN的表達(dá)情況。結(jié)果:1、RT-PCR和western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)轉(zhuǎn)染后的K562-S1與K562-S3細(xì)胞明顯的抑制了Bmi-1的表達(dá),而K562-S2與K562-S4細(xì)胞抑制Bmi-1的表達(dá)效果不如K562-S1與K562-S3細(xì)胞明顯,所以我們選用K562-S1和K562-S3細(xì)胞以及K562-W和K562-V細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2、MTT結(jié)果顯示經(jīng)不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的K562-S1和K562-S3細(xì)胞與K562-W和K562-V細(xì)胞相比生長(zhǎng)速度明顯受到抑制(P0.05),而K562-W和K562-V細(xì)胞之間無(wú)顯著性差異(P0.05)。3、透射電鏡掃描觀察細(xì)胞內(nèi)自噬情況顯示K562-S1和K562-S3細(xì)胞存在自噬小體,而K562-W和K562-V細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)自噬小體。4、Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)小干擾siRNA沉默Bmi-1基因后,自噬特異性蛋白Beclin1和LC3-II的表達(dá)增加,而p-Akt和mTOR的表達(dá)下降,且PTEN蛋白的表達(dá)增加。若在K562細(xì)胞中加入3-MA培養(yǎng)2h后再進(jìn)行轉(zhuǎn)染,則轉(zhuǎn)染后的K562-S1細(xì)胞中自噬特異性蛋白Beclin1和LC3-II的表達(dá)比未加3-MA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞明顯下降,并且加3-MA后轉(zhuǎn)染的K562-V細(xì)胞Beclin1和LC3-II的表達(dá)與未加3-MA的K562-V細(xì)胞相比無(wú)變化。而在轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的同時(shí)加入mTOR抑制劑雷帕霉素(Rapamycin)后,mTOR的表達(dá)相對(duì)減少,且自噬特異性蛋白Beclin1和LC3-II的表達(dá)相對(duì)增加。并且加3-MA后轉(zhuǎn)染的K562-V細(xì)胞mTOR的表達(dá)也相對(duì)減少,且自噬特異性蛋白Beclin1和LC3-II的表達(dá)也相對(duì)增加。結(jié)論:沉默Bmi-1基因的表達(dá)后會(huì)導(dǎo)致K562細(xì)胞發(fā)生自噬,其機(jī)制可能是Bmi-1-siRNA通過(guò)調(diào)控PTEN/Akt/mTOR通路實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：Bmi-1基因 siRNA 自噬 白血病
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 前言10-11
• 材料和方法11-20
• 結(jié)果20-24
• 討論24-28
• 結(jié)論28-29
• 參考文獻(xiàn)29-33
• 綜述33-43
• 參考文獻(xiàn)39-43
• 致謝43-44

【相似文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：siRNA沉默Bmi-1基因表達(dá)對(duì)K562細(xì)胞自噬的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：262584