【摘要】：【目的】利用Red同源重組系統(tǒng),通過二步PCR法建立一種適合鼠疫耶爾森菌s RNA和大片段染色體基因敲除的方法。【方法】第一步PCR先擴增出目的基因的上、下游同源臂(600 1000 bp)及卡那抗性盒,再以上、下游同源臂及卡那抗性盒等摩爾混合物為模板,通過融合PCR獲得含上下游同源臂及卡那抗性盒的線性突變盒,再將此突變盒的PCR產物電轉到含有pKD46質粒的鼠疫201菌株,在阿拉伯糖的誘導下,p KD46質粒表達Red重組酶,促使卡那抗性盒替換目的基因,最后對獲得的重組克隆進行PCR鑒定�！窘Y果】本研究通過兩步PCR法構建600 1000 bp的同源臂,提高了同源重組效率,并將鼠疫菌sRNA RyhB1(108 bp)和RyhB2(106 bp)和染色體大片段47-2(10.4 kb)、47-3(21.6 kb)、47-3a(9.2 kb)及47-3b(6.1 kb)成功敲除�！窘Y論】基于Red重組系統(tǒng)構建的二步法突變技術,是一種簡單、高效的精確修飾鼠疫菌s RNA及大片段染色體的方法,適合于鼠疫菌全基因組的基因敲除,為鼠疫菌基因表達與調控、致病和毒力等研究提供有力的工具。

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