【摘要】：一、目的 探索慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(CUMS)和利血平拮抗兩種抑郁癥大鼠模型肝郁脾虛證的證候時間窗；通過對證方劑反證兩種抑郁癥大鼠模型肝郁脾虛證證候時間窗的可靠性。探索抑郁癥大鼠肝郁脾虛證的下游即蛋白水平和上游即基因水平的生物學(xué)機制。 二、方法 (一)采用CUMS和腹腔注射利血平兩種方法建立大鼠抑郁癥模型,通過體重測定、糖水消耗實驗、行為學(xué)測定、臨床癥狀等效轉(zhuǎn)化為大鼠宏觀表征等方法來進行大鼠的證候判別。Elisa法測定血清中5-羥色胺(5-HT)含量,免疫組織化學(xué)法測定腦組織海馬CA2區(qū)5-HT含量； (二)根據(jù)實驗一得出的各時間點肝郁脾虛證大鼠所占比例調(diào)整各組大鼠的分配數(shù)量,仍采用CUMS和腹腔注射利血平兩種方法建立大鼠抑郁癥模型,證候判別方法同實驗一,根據(jù)實驗一得出的兩種模型的證候時間窗,利血平組肝郁脾虛證大鼠在注射藥物4周后予逍遙散灌胃,CUMS組肝郁脾虛證大鼠在應(yīng)激6周后予逍遙散灌胃,對于服用逍遙散后證候發(fā)生變化的大鼠停止使用逍遙散,但是指標(biāo)檢測和數(shù)據(jù)統(tǒng)計時仍將其計入。通過體重、糖水消耗實驗、行為學(xué)測定、宏觀表征量表積分等指標(biāo)的測定評估逍遙散對肝郁脾虛證大鼠的影響； (三) Elisa法檢測血清血管緊張素Ⅱ (AngⅡ)、去甲腎上腺素(NE)、同型半胱胺酸(HCY)、5-羥色胺(5-HT)、γ-氨基丁酸(GABA)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、多巴胺(DA)、β-內(nèi)啡肽、超氧化物歧化酶(SOD)、睪酮(T)、雌二醇(E2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。高效液相色譜法檢測腦組織中NE、DOPAC、 DA、5-HIAA、HVA和5-HT含量。免疫組化法檢測腎上腺組織中CORT表達量； (四)對抑郁癥肝郁脾虛證大鼠腦組織和肝組織進行數(shù)字化基因表達譜分析。第一步進行樣本質(zhì)量檢測,第二步制備DGE文庫,第三步上機測序,第四步進行生物信息分析。 三、結(jié)果 (一)綜合各時間點各組大鼠體重值、糖水偏嗜程度、行為學(xué)指標(biāo)、宏觀表征舌色RGB值得出：CUMS組和利血平組大鼠在干預(yù)2周后均出現(xiàn)了抑郁狀態(tài)；CUMS組大鼠應(yīng)激6周后出現(xiàn)肝郁脾虛證,利血平組大鼠注射藥物4周后出現(xiàn)肝郁脾虛證。與正常組相比,CUMS組和利血平組大鼠干預(yù)8周后腦組織5-HT含量降低(P0.05),血清和小腸組織5-HT含量持續(xù)升高(P0.05)且升高的程度兩組大鼠在不同時期存在差異。 (二)各組抑郁癥肝郁脾虛證大鼠在逍遙散灌胃后,體重值、糖水偏嗜程度、曠場實驗穿格次數(shù)和活動總距離、強迫游泳試驗中出現(xiàn)不動狀態(tài)時間均與實驗一同期相比有不同程度的改善,大鼠舌體R值兩實驗相比無明顯差異。同時,在本實驗中我們還對各組大鼠在逍遙散服用前及服用后各時間點進行了宏觀表征采集量表積分,發(fā)現(xiàn)在大鼠服用逍遙散后宏觀表征采集量表積分逐漸升高,逍遙散對抑郁癥肝郁脾虛證的證候療效是有效的。 (三)應(yīng)激性抑郁癥和利血平拮抗型抑郁癥肝郁脾虛證發(fā)生時,血清中含量上升的指標(biāo)有：Ang II.HCY.5-HT、CRH.ACTH;血清中含量下降的指標(biāo)有：GABA、cAMP、DA、β-內(nèi)啡肽、SOD、T、E2:血清中含量不變的指標(biāo)有TNF-α；腦組織中NE、DOPAC.DA.5-HIAA、HVA和5-HT含量均下降；腎上腺組織中CORT表達量上升。應(yīng)激性抑郁癥肝郁脾虛證發(fā)生時,血清NE含量先上升后下降；利血平拮抗型抑郁癥肝郁脾虛證發(fā)生時,血清NE含量持續(xù)下降。 (四)CUMS組肝郁脾虛證大鼠腦組織與正常組大鼠相比有190個基因上調(diào),684個基因下調(diào)；利血平組肝郁脾虛證大鼠腦組織與正常組大鼠相比有155個基因上調(diào),476個基因下調(diào)。CUMS組肝郁脾虛證大鼠肝組織與正常組大鼠相比有18個基因上調(diào),508個基因下調(diào)；利血平組肝郁脾虛證大鼠肝組織與正常組大鼠相比有88個基因上調(diào),420個基因下調(diào)。差異表達的基因作用的靶點主要集中在5-羥色胺突觸、GABA突觸、多巴胺突觸、鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、促性腺激素釋放激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、NO和谷氨酸鹽信號通路、抗原加工和呈遞過程、吞噬作用、腸道免疫網(wǎng)絡(luò)中。 四、結(jié)論 (一)抑郁癥肝郁脾虛證病證結(jié)合大鼠模型的證候時間窗 應(yīng)激性抑郁癥大鼠肝郁脾虛證的證候時間窗為應(yīng)激后6-8周；利血平拮抗型抑郁癥大鼠肝郁脾虛證的證候時間窗為注射藥物后4-8周。經(jīng)對證方劑反證后確認該時間窗是可靠的。 (二)抑郁癥肝郁脾虛證病證結(jié)合大鼠模型的下游生物學(xué)機制 1. CRH-ACTH-CORT通路被激活后呈正反饋調(diào)節(jié)參與了應(yīng)激性抑郁癥肝郁脾虛證的形成過程； 2.血清中AngⅡ、HCY、5-HT的升高和GABA、cAMP、DA、SOD、T、E2的下降以及腦組織中NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA和5-HT含量的下降是應(yīng)激性抑郁癥和利血平拮抗型抑郁癥肝郁脾證形成的共同機制。 (三)抑郁癥肝郁脾虛證病證結(jié)合大鼠模型的上游生物學(xué)機制 1.兩種抑郁癥肝郁脾虛證模型均與5-羥色胺突觸、GABA突觸、多巴胺突觸的功能異常有關(guān)。其中PKC基因和PKA基因是一對表達效應(yīng)相反的關(guān)鍵基因,Gi/o基因群在抑郁癥肝郁脾虛證中發(fā)揮著重要的作用。結(jié)合抑郁癥肝郁脾虛證的下游生物學(xué)機制,推測中樞5-HT與外周5-HT可能是兩個獨立的系統(tǒng),中樞PKA與外周cAMP可能存在共同通路并且共同參與了抑郁癥肝郁脾虛證的發(fā)生和發(fā)展過程； 2.兩種抑郁癥肝郁脾虛證模型均與鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常有密切關(guān)系； 3.兩種抑郁癥肝郁脾虛證模型均與免疫有關(guān),主要表現(xiàn)為主要組織相容性復(fù)合基因I型(MHCI)和主要組織相容性復(fù)合基因II型(MHCH)表達下調(diào)。結(jié)合抑郁癥肝郁脾虛證的下游生物學(xué)機制,推測炎性因子TNF-α可能沒有參與抑郁癥肝郁脾虛證與免疫相關(guān)的病理生理過程。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R-332;R277.7

【參考文獻】

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本文編號：2622924