發(fā)布時(shí)間：2020-04-10 19:28

【摘要】：研究目的本實(shí)驗(yàn)利用BALB/c小鼠的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg),研究在不同劑量、不同時(shí)間IL-15作用下,細(xì)胞發(fā)生自噬的情況以及免疫功能的變化。明確IL-15對(duì)Treg自噬作用和免疫功能影響。進(jìn)一步利用IL-15、自噬抑制劑SBI-0206965或自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(Rapamycin,Rap)處理細(xì)胞,探索IL-15通過(guò)調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞自噬影響其功能的相關(guān)分子機(jī)制。研究方法1、取BALB/c小鼠脾臟,通過(guò)MiniMACs免疫磁性分離系統(tǒng)從單個(gè)核細(xì)胞中分離CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞和CD4~+CD25~-T細(xì)胞(效應(yīng)性T細(xì)胞,Teff)。利用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純度鑒定和活力檢測(cè)。2、IL-15對(duì)Treg細(xì)胞相關(guān)分子Foxp3和CTLA-4表達(dá)的影響:將分離出的Treg細(xì)胞計(jì)數(shù),以2×10~5個(gè)/孔接種于96孔板。按照IL-15濃度分為10ng/ml組、25ng/ml組、50ng/ml組和100ng/ml組;按照培養(yǎng)時(shí)間分組,分為12h組、24h組、48h組和72h組。分別給予相應(yīng)劑量和IL-15處理相應(yīng)時(shí)間,置于37℃、5%CO_2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。分別收集細(xì)胞后,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Foxp3和CTLA-4表達(dá)水平。3、IL-15對(duì)Treg細(xì)胞自噬的相關(guān)分子LC3的影響:選取IL-15對(duì)Treg細(xì)胞活化影響的最佳劑量和時(shí)間條件。將分離出的Treg細(xì)胞計(jì)數(shù),以2×10~5個(gè)/孔接種于96孔板。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組:Control組、IL-15組、SBI組、IL-15+SBI組、Rap組、IL-15+Rap組。此外,為模擬膿毒癥體外環(huán)境加入LPS,進(jìn)行同樣的分組。分別給予相應(yīng)的試劑處理后,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色,共聚焦觀察LC3的表達(dá),研究Treg細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成情況。并收集細(xì)胞,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LC3分子表達(dá)水平。4、IL-15和細(xì)胞自噬對(duì)Treg細(xì)胞相關(guān)分子Foxp3和CTLA-4表達(dá)的影響:將分離出的Treg細(xì)胞計(jì)數(shù),以2×10~5個(gè)/孔接種于96孔板。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組:Control組、IL-15組、SBI組、IL-15+SBI組、Rap組、IL-15+Rap組。此外,為模擬膿毒癥體外環(huán)境加入LPS,進(jìn)行同樣的分組。收集細(xì)胞后,Foxp3和CTLA-4分子進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表達(dá)水平。5、IL-15對(duì)Treg細(xì)胞免疫功能的影響:采用ELISA法檢測(cè)各個(gè)分組上清液中IL-10和TGF-β水平的變化。并將Treg和Teff進(jìn)行共培養(yǎng)后,檢測(cè)上清液中IL-2、IFN-γ和IL-4的分泌水平。研究結(jié)果1、按上述步驟從BALB/c小鼠單個(gè)核細(xì)胞中分選出CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞后檢測(cè)其純度達(dá)到92%以上,Teff細(xì)胞的純度為95%,苔盼藍(lán)檢測(cè)到CD4~+CD25~+Treg的活性均在94%以上。2、IL-15在劑量為100ng/ml處理48h的條件下,Treg細(xì)胞表面分子Foxp3和CTLA-4的表達(dá)水平顯著增加(P0.01),在此情況下,IL-15對(duì)Treg細(xì)胞刺激最為明顯。因此選定該條件處理后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3、共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果均顯示,相較于Control組,IL-15組和SBI組LC3分子表達(dá)水平顯著減少,IL-15+SBI組明顯增加(P0.05),Rap組和IL-15+Rap組顯著上調(diào)(P0.01)。在LPS刺激Treg細(xì)胞條件下,較Control組,IL-15組和SBI組的LC3分子表達(dá)水平顯著下調(diào),IL-15+SBI組明顯增加(P0.05),Rap組和IL-15+Rap組顯著增強(qiáng)(P0.01)。4、流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示:相較于Control組,IL-15組和IL-15+Rap組細(xì)胞Foxp3表達(dá)顯著上調(diào)(P0.01),IL-15+SBI組和Rap組細(xì)胞Foxp3和CTLA-4表達(dá)均有增加(P0.05)。在LPS刺激Treg細(xì)胞條件下,IL-15+Rap組細(xì)胞Foxp3和CTLA-4表達(dá)水平在比Control組顯著增多(P0.01)。5、采用ELISA技術(shù)檢測(cè)各個(gè)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子分泌水平,結(jié)果證實(shí)加入IL-15處理后,IL-10和TGF-β水平均有明顯上升(P0.01)。在與Teff共培養(yǎng)后,IL-15組細(xì)胞分泌IFN-γ/IL-4比值較Control組有所下降,Teff具有向Th2極化的趨勢(shì)。結(jié)論:100ng/ml IL-15在處理Treg細(xì)胞48h后,可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)相關(guān)分子Foxp3和CLTA-4,并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。IL-15通過(guò)CD4~+CD25~+Treg自噬介導(dǎo)其活化并發(fā)揮免疫抑制功能。
【圖文】：

加 1ml 1x 破膜劑緩沖液洗滌，，1100r/min，離心聚甲醛將其固定，流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果PSS19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有計(jì)量（x± s），組間差異采用單因素方差分析進(jìn)行比較，兩驗(yàn)，當(dāng) P<0.05 時(shí)，差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。果ALB/c 小鼠脾臟分離 CD4+CD25+Treg 細(xì)胞的純度測(cè)定LB/c 小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞分選出 CD4+CD25+Treg 細(xì)CD4+CD25-Teff 的純度為 95%（見(jiàn)圖 1），苔盼藍(lán)檢測(cè)在 94%以上。a b

加 1ml 1x 破膜劑緩沖液洗滌，1100r/min，離心聚甲醛將其固定，流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果PSS19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有計(jì)量（x± s），組間差異采用單因素方差分析進(jìn)行比較，兩驗(yàn)，當(dāng) P<0.05 時(shí)，差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。果ALB/c 小鼠脾臟分離 CD4+CD25+Treg 細(xì)胞的純度測(cè)定LB/c 小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞分選出 CD4+CD25+Treg 細(xì)CD4+CD25-Teff 的純度為 95%（見(jiàn)圖 1），苔盼藍(lán)檢測(cè)在 94%以上。a b
【學(xué)位授予單位】：廣西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

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