發(fā)布時間：2020-04-10 19:28

【摘要】：研究目的本實驗利用BALB/c小鼠的調(diào)節(jié)性T細胞(Treg),研究在不同劑量、不同時間IL-15作用下,細胞發(fā)生自噬的情況以及免疫功能的變化。明確IL-15對Treg自噬作用和免疫功能影響。進一步利用IL-15、自噬抑制劑SBI-0206965或自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(Rapamycin,Rap)處理細胞,探索IL-15通過調(diào)節(jié)Treg細胞自噬影響其功能的相關(guān)分子機制。研究方法1、取BALB/c小鼠脾臟,通過MiniMACs免疫磁性分離系統(tǒng)從單個核細胞中分離CD4~+CD25~+Treg細胞和CD4~+CD25~-T細胞(效應(yīng)性T細胞,Teff)。利用流式細胞技術(shù)對細胞進行純度鑒定和活力檢測。2、IL-15對Treg細胞相關(guān)分子Foxp3和CTLA-4表達的影響:將分離出的Treg細胞計數(shù),以2×10~5個/孔接種于96孔板。按照IL-15濃度分為10ng/ml組、25ng/ml組、50ng/ml組和100ng/ml組;按照培養(yǎng)時間分組,分為12h組、24h組、48h組和72h組。分別給予相應(yīng)劑量和IL-15處理相應(yīng)時間,置于37℃、5%CO_2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。分別收集細胞后,采用流式細胞術(shù)檢測Foxp3和CTLA-4表達水平。3、IL-15對Treg細胞自噬的相關(guān)分子LC3的影響:選取IL-15對Treg細胞活化影響的最佳劑量和時間條件。將分離出的Treg細胞計數(shù),以2×10~5個/孔接種于96孔板。對細胞進行分組:Control組、IL-15組、SBI組、IL-15+SBI組、Rap組、IL-15+Rap組。此外,為模擬膿毒癥體外環(huán)境加入LPS,進行同樣的分組。分別給予相應(yīng)的試劑處理后,對細胞進行免疫熒光染色,共聚焦觀察LC3的表達,研究Treg細胞內(nèi)自噬體的形成情況。并收集細胞,利用流式細胞術(shù)檢測LC3分子表達水平。4、IL-15和細胞自噬對Treg細胞相關(guān)分子Foxp3和CTLA-4表達的影響:將分離出的Treg細胞計數(shù),以2×10~5個/孔接種于96孔板。對細胞進行分組:Control組、IL-15組、SBI組、IL-15+SBI組、Rap組、IL-15+Rap組。此外,為模擬膿毒癥體外環(huán)境加入LPS,進行同樣的分組。收集細胞后,Foxp3和CTLA-4分子進行流式細胞術(shù)檢測其表達水平。5、IL-15對Treg細胞免疫功能的影響:采用ELISA法檢測各個分組上清液中IL-10和TGF-β水平的變化。并將Treg和Teff進行共培養(yǎng)后,檢測上清液中IL-2、IFN-γ和IL-4的分泌水平。研究結(jié)果1、按上述步驟從BALB/c小鼠單個核細胞中分選出CD4~+CD25~+Treg細胞后檢測其純度達到92%以上,Teff細胞的純度為95%,苔盼藍檢測到CD4~+CD25~+Treg的活性均在94%以上。2、IL-15在劑量為100ng/ml處理48h的條件下,Treg細胞表面分子Foxp3和CTLA-4的表達水平顯著增加(P0.01),在此情況下,IL-15對Treg細胞刺激最為明顯。因此選定該條件處理后續(xù)實驗。3、共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光和流式細胞術(shù)分析結(jié)果均顯示,相較于Control組,IL-15組和SBI組LC3分子表達水平顯著減少,IL-15+SBI組明顯增加(P0.05),Rap組和IL-15+Rap組顯著上調(diào)(P0.01)。在LPS刺激Treg細胞條件下,較Control組,IL-15組和SBI組的LC3分子表達水平顯著下調(diào),IL-15+SBI組明顯增加(P0.05),Rap組和IL-15+Rap組顯著增強(P0.01)。4、流式細胞分析結(jié)果顯示:相較于Control組,IL-15組和IL-15+Rap組細胞Foxp3表達顯著上調(diào)(P0.01),IL-15+SBI組和Rap組細胞Foxp3和CTLA-4表達均有增加(P0.05)。在LPS刺激Treg細胞條件下,IL-15+Rap組細胞Foxp3和CTLA-4表達水平在比Control組顯著增多(P0.01)。5、采用ELISA技術(shù)檢測各個組細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子分泌水平,結(jié)果證實加入IL-15處理后,IL-10和TGF-β水平均有明顯上升(P0.01)。在與Teff共培養(yǎng)后,IL-15組細胞分泌IFN-γ/IL-4比值較Control組有所下降,Teff具有向Th2極化的趨勢。結(jié)論:100ng/ml IL-15在處理Treg細胞48h后,可明顯誘導(dǎo)細胞表達相關(guān)分子Foxp3和CLTA-4,并誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生。IL-15通過CD4~+CD25~+Treg自噬介導(dǎo)其活化并發(fā)揮免疫抑制功能。
【圖文】：

加 1ml 1x 破膜劑緩沖液洗滌，，1100r/min，離心聚甲醛將其固定，流式細胞儀對其進行檢測。統(tǒng)計學(xué)處理實驗結(jié)果PSS19.0 統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，所有計量（x± s），組間差異采用單因素方差分析進行比較，兩驗，當 P<0.05 時，差異被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。果ALB/c 小鼠脾臟分離 CD4+CD25+Treg 細胞的純度測定LB/c 小鼠脾臟單個核細胞分選出 CD4+CD25+Treg 細CD4+CD25-Teff 的純度為 95%（見圖 1），苔盼藍檢測在 94%以上。a b

加 1ml 1x 破膜劑緩沖液洗滌，1100r/min，離心聚甲醛將其固定，流式細胞儀對其進行檢測。統(tǒng)計學(xué)處理實驗結(jié)果PSS19.0 統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，所有計量（x± s），組間差異采用單因素方差分析進行比較，兩驗，當 P<0.05 時，差異被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。果ALB/c 小鼠脾臟分離 CD4+CD25+Treg 細胞的純度測定LB/c 小鼠脾臟單個核細胞分選出 CD4+CD25+Treg 細CD4+CD25-Teff 的純度為 95%（見圖 1），苔盼藍檢測在 94%以上。a b
【學(xué)位授予單位】：廣西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

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本文編號：2622625