【摘要】：目的:通過(guò)原核重組表達(dá)獲得鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii,AB)重組蛋白OmpK、Omp22及Omp K/Omp22融合蛋白,動(dòng)物免疫接種后檢測(cè)并比較分析其免疫原性和免疫保護(hù)性,探討構(gòu)建鮑曼不動(dòng)桿菌基因重組亞單位疫苗的新策略。方法:1.采用PCR的方法以鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606基因組DNA為模板擴(kuò)增OmpK、Omp22基因,并通過(guò)重疊延伸PCR獲得OmpK/Omp22融合基因,將OmpK、Omp22基因及OmpK/Omp22融合基因分別克隆入pColdI質(zhì)粒載體,對(duì)篩選到的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和DNA測(cè)序鑒定。將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)株,重組菌經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)后,鎳親和柱純化重組蛋白。2.分別將3種重組蛋白各20μg(溶于PBS緩沖液50μL)與等體積弗氏佐劑混合后作為抗原免疫接種Balb/c小鼠,并于初次免疫后第14、21天以相同劑量重組蛋白與弗氏佐劑混合后各加強(qiáng)免疫一次,設(shè)置PBS對(duì)照組(即只給每只動(dòng)物注射PBS溶液50μL和等體積弗氏佐劑)。于末次免疫后第7、21天小鼠內(nèi)眥取血,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定抗血清效價(jià)。3.末次免疫后第3周分離小鼠脾淋巴細(xì)胞,體外經(jīng)相應(yīng)抗原刺激后,MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖水平,ELISA法測(cè)定IFN-γ細(xì)胞因子釋放水平。4.末次免疫3周后以鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株攻擊免疫小鼠,記錄小鼠存活率,采集小鼠外周血檢測(cè)其細(xì)菌載量,分離小鼠肺組織HE染色后觀(guān)察其病理變化。結(jié)果:成功構(gòu)建了3個(gè)重組質(zhì)粒pColdI-OmpK/Omp22、pColdI-OmpK、pColdI-Omp22,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)株后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可表達(dá)分子量與理論值一致的3個(gè)重組蛋白OmpK/Omp22、OmpK、Omp22,純化的重組蛋白免疫小鼠后獲得的抗血清均具有特異性,末次免疫后的第7、21天融合蛋白OmpK/Omp22免疫組小鼠血清抗體滴度明顯高于Omp K免疫組及Omp22免疫組(P0.05)。Omp K/Omp22免疫組小鼠的脾淋巴細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)抗原再次刺激后的淋巴細(xì)胞增殖率明顯高于OmpK免疫組及Omp22免疫組(P0.05)。OmpK/Omp22、OmpK、Omp22免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN-γ產(chǎn)量分別為:0.521±0.069ng/mL,0.48±0.042ng/mL,0.485±0.050ng/mL均高于PBS對(duì)照組(0.423±0.1088ng/mL)。PBS對(duì)照組小鼠受到鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離菌株攻擊感染后72h內(nèi)全部死亡,而直至攻擊感染后第8天OmpK/Omp22、Omp K、Omp22免疫組小鼠存活率分別為66.7%,25%,37.5%。OmpK/Omp22、OmpK、Omp22免疫小鼠外周血細(xì)菌載量均低于PBS對(duì)照組(P0.05),而OmpK/Omp22融合蛋白組細(xì)菌載量最低(P0.01)。肺組織HE染色結(jié)果顯示PBS對(duì)照組肺組織存在嚴(yán)重的間質(zhì)性肺炎改變,其血管周?chē)梢?jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),OmpK和Omp22免疫小鼠的肺組織出現(xiàn)中等度肺炎改變及中等度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),而Omp K/Omp22融合蛋白免疫組小鼠肺組織僅表現(xiàn)為輕度的炎癥反應(yīng)和極少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)論:3種重組蛋白小鼠免疫接種后均表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫原性和一定程度的免疫保護(hù)性,融合蛋白OmpK/Omp22的免疫原性和免疫保護(hù)性明顯強(qiáng)于單個(gè)重組蛋白OmpK及Omp22。該研究結(jié)果可為進(jìn)一步優(yōu)化鮑曼不動(dòng)桿菌亞單位疫苗分子設(shè)計(jì)以及構(gòu)建包含多個(gè)抗原組分的多亞單位疫苗等研究提供參考依據(jù)。
【圖文】：

曼不動(dòng)桿菌 OmpK、Omp22 基因及 OmpK/Omp22 融合PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖（DL2000）；1：OmpK 基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；2：Omp22 融合基因的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物菌 OmpK、Omp22 及 OmpK/Omp22 基因mp22 基因及 OmpK/Omp22 融合基因經(jīng) B與經(jīng) BamHⅠ/SalⅠ雙酶切的載體進(jìn)行連接隨機(jī)挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，篩選到分子量組質(zhì)粒，，分別命名為 pColdI-OmpK/Omp22、，3 種重組質(zhì)粒經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶消化后進(jìn)行Omp22 經(jīng) BamH I 和 SalⅠ雙酶切后釋放 pK 經(jīng) BamH I 和 SalⅠ雙酶切后釋放 750b

圖 2 重組表達(dá)質(zhì)粒 pColdI-OmpK 的酶切鑒定圖譜分子量標(biāo)準(zhǔn)(λDNA EcoRⅠ/HindⅢ); 1：質(zhì)粒 pColdI; 2:重組質(zhì)粒 pColdI-OmpK; 3 經(jīng) BamHⅠ單酶切分析; 4: 重組質(zhì)粒 pColdI-OmpK 經(jīng) BamHⅠ單酶切分析；5：重-OmpK 的 BamHⅠ/SalⅠ雙酶切分析
【學(xué)位授予單位】：川北醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Ming-Feng Lin;Chung-Yu Lan;;Antimicrobial resistance in Acinetobacter baumannii : From bench to bedside[J];World Journal of Clinical Cases;2014年12期

2 謝勇恩;唐恩潔;任碧軒;;DNA免疫法制備抗Prohibitin多克隆抗體的實(shí)驗(yàn)研究[J];免疫學(xué)雜志;2010年07期

本文編號(hào)：2622593