【摘要】：眾所周知,活性氧(reactive oxygen species,ROS)是一種氧代謝副產(chǎn)物,普遍存在于所有細(xì)胞中,與抗氧化劑相互平衡。當(dāng)細(xì)胞中活性氧含量過(guò)量或抗氧化劑耗竭又或者兩者兼而有之時(shí),會(huì)導(dǎo)致這種微妙的平衡受到干擾,發(fā)生氧化應(yīng)激。在活性氧處于中等水平時(shí),活性氧可以發(fā)揮一些積極作用,參與相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑,例如針對(duì)病原體的防御或精子中的受精準(zhǔn)備。然而,過(guò)高水平的活性氧以其破壞作用被大眾所知,影響所有生物分子并最終導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激甚至死亡。線粒體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中ROS的主要產(chǎn)生者和靶標(biāo)。人類精子內(nèi)活性氧水平氧化應(yīng)激導(dǎo)致精液參數(shù)異常,與男性不育癥密切相關(guān),已成為男性不育的重要因素。自噬對(duì)應(yīng)激反應(yīng)做出應(yīng)答及清除氧化受損細(xì)胞器起重要作用。本研究以人類精子為實(shí)驗(yàn)材料,建立精子氧化應(yīng)激方法,利用免疫熒光結(jié)合激光共聚焦熒光顯微鏡觀察外源性過(guò)氧化氫和超低溫保存這兩種形式的氧化應(yīng)激對(duì)人類精子內(nèi)自噬的影響。首先采用非連續(xù)密度梯度法優(yōu)選人類精子,降低精液中雜質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響;利用計(jì)算機(jī)輔助精子分析精液常規(guī)參數(shù);不同濃度的外源性過(guò)氧化氫處理精子(0 mM H_2O_2、0.5 mM H_2O_2、1 mM H_2O_2),建立氧化應(yīng)激方法;程序性液氮超低溫保存精子標(biāo)本,建立氧化應(yīng)激方法;利用DCFH-DA探針染色的方法檢測(cè)人類精子內(nèi)活性氧水平;利用MitoTracker?Red CMXRos探針染色的方法檢測(cè)人類精子線粒體膜電位變化情況;利用Western Blot驗(yàn)證人類精子內(nèi)自噬起始蛋白的表達(dá);利用免疫熒光結(jié)合激光共聚焦熒光顯微鏡觀察人類精子內(nèi)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)定位;利用免疫熒光共定位結(jié)合激光共聚焦熒光顯微鏡觀察人類精子線粒體自噬蛋白的表達(dá)定位。取得的主要結(jié)果如下:(1)新鮮精液液化后,采用非連續(xù)密度梯度離心法優(yōu)選后的人類精子。經(jīng)計(jì)算機(jī)輔助精子分析,洗滌后與洗滌前相比,PR%顯著升高,PR+NP%也顯著升高。(2)經(jīng)計(jì)算機(jī)輔助精子分析,過(guò)氧化氫組(0.5 mM H_2O_2、1 mM H_2O_2)與對(duì)照組(H_2O)相比PR%顯著降低,PR+NP%也顯著降低。分析精子內(nèi)活性氧水平發(fā)現(xiàn),過(guò)氧化氫組(0.5 mM H_2O_2、1 mM H_2O_2)與對(duì)照組(H_2O)相比精子內(nèi)活性氧水平顯著升高。對(duì)精子線粒體膜電位分析發(fā)現(xiàn),過(guò)氧化氫組(0.5 mM H_2O_2、1 mM H_2O_2)與對(duì)照組(H_2O)相比精子線粒體膜電位顯著降低。Western Blot驗(yàn)證人類精子內(nèi)自噬起始蛋白,結(jié)果顯示,過(guò)氧化氫組(0.5 mM H_2O_2)與對(duì)照組(H_2O)相比精子內(nèi)LC3-II/LC3-I比值顯著升高。免疫熒光結(jié)合激光共聚焦熒光顯微鏡分析,自噬蛋白LC3表達(dá)主要位于精子頭部及尾部中段,過(guò)氧化氫組(0.5 mM H_2O_2、1 mM H_2O_2)與對(duì)照組(H_2O)相比LC3表達(dá)量顯著升高;自噬蛋白p62表達(dá)主要位于精子頭部及尾部中段,過(guò)氧化氫組(0.5 mM H_2O_2、1 mM H_2O_2)與對(duì)照組(H_2O)相比p62表達(dá)量顯著升高。免疫熒光結(jié)合激光共聚焦熒光顯微鏡分析發(fā)現(xiàn),外源性過(guò)氧化氫處理后,自噬蛋白LC3與精子線粒體共定位,表明線粒體發(fā)生自噬。(3)經(jīng)計(jì)算機(jī)輔助精子分析,融解后與冷凍前相比PR%顯著降低、PR+NP%也顯著降低。分析精子內(nèi)活性氧水平發(fā)現(xiàn),融解后與冷凍前相比精子內(nèi)活性氧水平極顯著升高。對(duì)精子線粒體膜電位分析發(fā)現(xiàn),融解后與冷凍前相比精子線粒體膜電位顯著降低。免疫熒光結(jié)合激光共聚焦熒光顯微鏡分析發(fā)現(xiàn),自噬蛋白LC3表達(dá)主要位于精子頭部及尾部,融解后與冷凍前相比LC3表達(dá)量極顯著升高;自噬蛋白p62表達(dá)主要位于精子頭部及尾部中段,融解后與冷凍前相比p62表達(dá)量極顯著升高。綜上所述,氧化應(yīng)激(外源性過(guò)氧化氫和超低溫保存)對(duì)人類精子造成氧化損傷,使人類精子內(nèi)活性氧水平升高,線粒體膜電位下降,導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)能力下降;過(guò)量活性氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激激活精子自噬,但自噬過(guò)程受阻,自噬溶酶體降解效率低。
【圖文】：

p62 參與通過(guò)選擇性自噬降解泛素化和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)[45]。1-1 Involvement of p62 in the degradation of ubiquitinated and misfolded ective autophagy. 細(xì)胞內(nèi) p62 水平受轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯后自噬降解之間的平衡調(diào)節(jié)[45]。 1-2 Balanced regulation of intracellular p62 levels by transcriptional regulat

2)處理非連續(xù)密度梯度離心法優(yōu)選的人類精子，在37°C孵育1 h后。結(jié)果如圖4-1(A)所示，精子內(nèi)活性氧主要為尾部中段線粒體區(qū)域，隨著過(guò)氧化氫的濃度增加，活性氧在精子頭部彌散分布。結(jié)合軟件分析，對(duì)照組正常人類精子內(nèi)活性氧水平較低，H2O2組與對(duì)照組相比，，存在顯著差異(P < 0.05)，活性氧水平明顯高于對(duì)照組(H2O)。結(jié)合精液常規(guī)檢測(cè)的結(jié)果，可以得知人類精子在外源性過(guò)氧化氫的BWW 培養(yǎng)液中在 37°C 孵育 1 h 后，造?
【學(xué)位授予單位】：煙臺(tái)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R321.1

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本文編號(hào)：2618590