【摘要】：日本乙型腦炎(Epidemic encephalitis B)是由流行性乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染而引發(fā)的人畜共患傳染病。乙型腦炎病毒在全世界范圍內(nèi)危害嚴(yán)重。干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白(Interferon-induced transmemberane proteins,IFITMs)是受干擾素(Interferon,IFNs)誘導(dǎo)的小分子跨膜蛋白,研究顯示IFITM家族蛋白具有廣譜抗病毒的能力。實(shí)驗(yàn)室前期研究初步證明豬源干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白(sIFITMs)具有抑制JEV作用,為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制和在乙型腦炎發(fā)生發(fā)展中的作用,開(kāi)展了相關(guān)研究,研究結(jié)果如下:1、采用熒光定量PCR檢測(cè)過(guò)量表達(dá)IFTIMs時(shí)JEV的復(fù)制。結(jié)果表明,在PK15、HEK293細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)sIFITM1、sIFITM2、sIFITM3蛋白,在24h、48h、72h均顯著抑制JEV病毒的復(fù)制,其中sIFITM1具有較強(qiáng)抑制病毒復(fù)制的能力。為進(jìn)一步驗(yàn)證sIFITM1對(duì)病毒復(fù)制的影響,通過(guò)CRISPR/cas9技術(shù)在PK15細(xì)胞和ST細(xì)胞中敲除sIFITM1,結(jié)果顯示,在24h,缺失sIFITM1能顯著提高JEV病毒復(fù)制。2、為了探討sIFITMs的抗JEV機(jī)制,篩選并研究其相互作用蛋白。采用酵母雙雜交試驗(yàn)證實(shí)了sIFITM1、sIFITM2、sIFITM3與sABHD16A均存在相互作用關(guān)系。在PK15、HEK293細(xì)胞中,通過(guò)亞細(xì)胞共定位,發(fā)現(xiàn)sIFITM1與sABHD16A存在共定位膜性結(jié)構(gòu)上,且在JEV感染細(xì)胞后,sIFITM1與sABHD16A的共定位區(qū)域隨著病毒的感染發(fā)生轉(zhuǎn)移。3、通過(guò)在BHK21、L02、HEK293細(xì)胞中過(guò)表達(dá)sABHD16A,24h、48h、72h檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清,結(jié)果表明sABHD16A顯著抑制JEV病毒復(fù)制。構(gòu)建CRISPR/cas9敲除載體pHMG-sgRNA-ssgRNA-abhd16a,在PK15、ST細(xì)胞中敲除sabhd16a,該細(xì)胞感染JEV 24h后,與對(duì)照組相比具有差異性顯著提高JEV復(fù)制。4、將pHMG-sgRNA-ssgRNA-abhd16a轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,篩選并構(gòu)建了單克隆穩(wěn)定缺失sABHD16A~(-/-)的細(xì)胞系,DNA測(cè)序結(jié)果顯示,HEK293細(xì)胞中sABHD16A被成功敲除。5、為了探究sIFITM1和sABHD16A的相互作用對(duì)JEV感染的影響,sIFITM1和sABHD16A表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,結(jié)果顯示共表達(dá)兩種蛋白時(shí)的抗病毒作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)表達(dá)IFITM1,說(shuō)明sABHD16A具有協(xié)同sIFITM1抗JEV作用。6、為了研究sIFITM1抗JEV作用是否與sIFITM1的S-棕櫚酰化有關(guān),構(gòu)建了S-棕櫚�；稽c(diǎn)突變體表達(dá)質(zhì)粒▲sIFITM1(sIFITM1-C50A-C51A-C84A),轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞,與轉(zhuǎn)染sIFITM1、sABHD16A、共轉(zhuǎn)sIFITM1/sABHD16A相比,轉(zhuǎn)染▲sIFITM1時(shí),對(duì)JEV的抑制明顯減弱,共轉(zhuǎn)染▲sIFITM1/sIFITM1時(shí)的協(xié)同抗JEV活性也明顯降低。該結(jié)果初步證明sIFITM1的抗JEV作用與其棕櫚�；嘘P(guān),而該位點(diǎn)的棕櫚�；赡芘csABHD16A有關(guān)。7、為明確sIFITM與sABHD16A是否參與調(diào)控JEV,通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)sIFITM1或sABHD16A的細(xì)胞中炎癥相關(guān)因子的表達(dá)水平,結(jié)果顯示IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α和COX2的mRNA水平均顯著升高。但共表達(dá)sIFITM1/sABHD16A時(shí),除了COX2之外,這些細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平顯著降低。JEV感染過(guò)表達(dá)sABHD16A的細(xì)胞時(shí),IL-1β,IL-6和TNF-α表達(dá)水平顯著上升,而JEV感染共表達(dá)sIFITM1/sABHD16A的細(xì)胞時(shí),與其對(duì)照組和其他感染細(xì)胞相比,炎癥因子表達(dá)水平則有所下降,說(shuō)明sIFITM1在調(diào)節(jié)炎癥平衡方面可發(fā)揮重要作用。本研究所取得的結(jié)果,不僅為后續(xù)研究開(kāi)展提供了一系列實(shí)驗(yàn)材料,也為乙型腦炎的預(yù)防和治療提供了理論支持。
【圖文】：

圖 1-1：日本腦炎的地理分布re1-1: Geographic distribution of Japanese encephalitis（Travelers' Health: Yellow Book of Specific Infectious Diseases, Japanese Encephalitis, Map 4-06 Geographic distributioencephalitis）

圖 1-2：JEV 基因組結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)A：基因組結(jié)構(gòu)。正鏈基因組 RNA 在 5'-3'方向含有帽子結(jié)構(gòu)，，5'NCR，長(zhǎng) ORF 和 3'NCR。B：基因表達(dá)(引自 Yun S I, Lee Y M. Japanese encephalitis: the virus and vaccines[10])Figure 1-2: JEV genome structure and gene expression.A: Genome structure. Positive strand genomic RNA contains a cap structure in the 5'-3' direction, a 5' NCR, a lo
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R373.21

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2614163