發(fā)布時間：2020-04-04 22:41

【摘要】：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是世界上常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,隨著年齡增加,其發(fā)病率逐漸增高。PD主要病理改變是黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta,Snc)內(nèi)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元減少,從而導致Snc-紋狀體通路中DA釋放減少。PD病因和致病機制目前尚不清楚,其并非單一因素所致,而是年齡、環(huán)境、遺傳等因素交互作用的結(jié)果。目前臨床上無藥物能夠減緩阻止及逆轉(zhuǎn)DA能神經(jīng)元變性過程。無論是藥物治療,還是手術(shù)治療,都不能根治PD,且會產(chǎn)生明顯副作用。PD主要病變是Snc部DA能神經(jīng)元丟失導致紋狀體內(nèi)DA水平下降,且PD患者腦中病變部位明確,因此PD成為神經(jīng)系統(tǒng)病變中進行基因治療熱門病種。本文中,通過構(gòu)建過表達多巴胺脫羧酶(dopamine decarboxylase,DDC)、酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate,GTP)環(huán)化水解酶(GTP cyclihydrolase1,GCH1)的重組慢病毒(recombinant lentivirus,rLV),將DDC+TH+GCH1-rLV注射至6-羥基多巴(6-hydroxydopamine,6-OHDA)制備的PD模型大鼠紋狀體中,觀察病毒在PD大鼠腦內(nèi)的表達情況及大鼠的旋轉(zhuǎn)行為學改變。采用攜帶產(chǎn)酶基因重組病毒載體,在動物模型中進行治療,擬重建紋狀體DA水平,以期待達到預期治療效果。第一部分過表達DDC,TH和GCH1 rLV及對照rLV制備及鑒定目的構(gòu)建DDC+TH+GCH1-rLV及對照rLV載體。方法PCR擴增各目的基因片段DDC、SV40 early promoter、TH、mPGK promoter、GCH1,使用BamHI-HF和XhoI對載體pMT174(pLV-RSV-CMV-WPRE)進行酶切,回收載體片段備用。進而在無縫反應液作用下,將各目的片段與回收后的線性化表達載體進行同源重組。利用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子,陽性克隆送測序,測序無誤后進行質(zhì)粒提抽。最后目的質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒pCMV-dR8.9、pCMV-VSV-G共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞進行病毒包裝,經(jīng)純化、濃縮后保存?zhèn)溆谩Ｈ舆M行RT-PCR滴度測定。取出DDC+TH+GCH-rLV及對照rLV冰上融化,感染HEK293T細胞。72 h后,提取總蛋白,對DDC、TH、GCH1進行Western blot檢測。結(jié)果PCR結(jié)果顯示,在1429 bp、412 bp、1614 bp、551 bp、791 bp處可見特異性目的基因DDC,SV40 early promoter,TH,mPGK promoter,GCH1目的基因條帶;使用BamHI-HF和XhoI對工具載體pMT174進行酶切,回收6508 bp載體片段;菌落PCR轉(zhuǎn)化子鑒定結(jié)果顯示,陽性克隆得到1436 bp片段;測序結(jié)果正確;與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,72小時后獲得DDC+TH+GCH1-rLV和對照rLV顆粒,經(jīng)過純化濃縮后-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ舆M行RT-PCR滴度測定,分別為5.56×10~8 v·g·mL~(-1)、1.07×10~9 v·g·mL~(-1)。Western blot結(jié)果可見,DDC+TH+GCH1-rLV感染組在3種DDC、TH和GCH1蛋白相對分子質(zhì)量處可見特異性的蛋白分子表達條帶。結(jié)論成功構(gòu)建DDC+TH+GCH1-rLV及對照rLV,其濃度及所攜帶基因功能滿足后續(xù)實驗需要。第二部分過表達DDC,TH和GCH1 rLV在PD大鼠模型中的作用探究目的評價DDC+TH+GCH1-rLV對PD大鼠模型的治療效果,檢測目的基因是否正確表達。方法大鼠6-OHDA MFB兩點法立體注射,構(gòu)造單側(cè)損毀PD模型。挑選完全損傷模型,其標準為旋轉(zhuǎn)圈數(shù)每分鐘7圈,或30分鐘210圈。運用Snc部TH免疫熒光,檢測PD大鼠DA能神經(jīng)元損毀情況。24只PD大鼠模型分為隨機分為三組:生理鹽水組(n=6)、陰性病毒組(n=6)和陽性病毒組(n=12),分別經(jīng)立體定向向大鼠紋狀體三點注射生理鹽水、對照rLV和DDC+TH+GCH1-rLV。觀察構(gòu)建病毒對PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為的影響,免疫熒光法檢測病毒轉(zhuǎn)染情況,同時使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)檢測紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物改變情況。結(jié)果6-OHDA MFB兩點法立體注射構(gòu)建PD大鼠模型,符合PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為標準,挑選PD模型大鼠。PD大鼠Snc部TH免疫熒光結(jié)果顯示:損毀側(cè)DA能神經(jīng)元大量丟失(P0.01),行為學觀察及免疫熒光檢測證明PD模型構(gòu)建成功。PD大鼠紋狀體注射后,陽性病毒組行為改變與生理鹽水組、陰性病毒組比較,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P0.01);陽性病毒組呈現(xiàn)出顯著的旋轉(zhuǎn)行為改善。免疫熒光顯示陽性病毒轉(zhuǎn)染表達有TH活性的陽性細胞。陽性病毒組紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物與生理鹽水組、陰性病毒組間比較,顯著增高(P0.01)。結(jié)論DDC+TH+GCH1-rLV在PD模型大鼠中呈現(xiàn)出顯著的行為改善,DA水平增加及穩(wěn)定的目的基因表達。
【圖文】：

南京醫(yī)科大學碩士學位論文結(jié) 果1、PCR 擴增各目的基因瓊脂糖凝膠及表達載體 pMT174 酶切結(jié)果以人工合成的 cDNA 為模板，引物(表 1)擴增各目的基因，結(jié)果在 1429 bp、412 bp、1614 bp、551 bp、791 bp 處可見特異性目的基因 DDC，SV40 earlypromoter，TH，mPGK promoter，GCH1 目的基因條帶(圖 1)。瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒回收各目的基因備用。用 BamHI-HF 和 XhoI 對工具載體 pMT174 進行酶切，回收 6508 bp 載體片段(圖 2)，工具載體備用。

TH，，mPGK promoter，GCH1 目的基因條帶(圖 1)。瓊脂糖凝膠 D劑盒回收各目的基因備用。用 BamHI-HF 和 XhoI 對工具載體 pMT174，回收 6508 bp 載體片段(圖 2)，工具載體備用。圖 1 各目的基因 PCR 擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果道為 DDC 基因擴增產(chǎn)物，2 泳道為 SV40 early promoter 基因擴增產(chǎn)物，3 泳道擴增產(chǎn)物，4 泳道為 mPGK promoter 基因擴增產(chǎn)物，5 泳道為 GCH1 基因擴增產(chǎn)NAladder Marker。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R742.5;R-332

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 楊謙謙;孫芳玲;艾厚喜;張麗;蔣瑩;王文;;6-羥基多巴胺誘導帕金森病動物模型及其研究進展[J];中國康復理論與實踐;2013年11期

2 牛朝詩;李健;;立體定向技術(shù)注射6-OHDA至內(nèi)側(cè)前腦束建立帕金森病大鼠模型[J];立體定向和功能性神經(jīng)外科雜志;2007年01期

3 羅蔚鋒;包仕堯;劉春風;霍紅梅;張志琳;韓旺;吳冠會;;內(nèi)側(cè)前腦束不同部位注射6-羥多巴胺建立帕金森病大鼠模型的對比性研究[J];蘇州大學學報(醫(yī)學版);2007年01期

本文編號：2614158