【摘要】：背景結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的、經(jīng)呼吸道傳播的慢性傳染病。TB是目前全球造成死亡人數(shù)最多的傳染病。TB惟一批準(zhǔn)使用的疫苗是卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG),可有效預(yù)防兒童TB,但是對(duì)成人TB保護(hù)效果不理想。在BCG中表達(dá)Mtb免疫優(yōu)勢(shì)抗原,以提高BCG免疫效率,是新型TB疫苗研究的重要方向。但是,目前仍沒有獲得能夠替代BCG的重組BCG(recombinant BCG,rBCG)疫苗。因此,應(yīng)當(dāng)積極探索新的疫苗構(gòu)建方式,以獲得保護(hù)效果和安全性均優(yōu)于BCG的rBCG。環(huán)二腺苷酸(cyclic di-adenosine monophosphate,c-di-AMP)是細(xì)菌第二信號(hào)分子,不僅參與調(diào)節(jié)細(xì)菌多種生理過程,還可誘導(dǎo)固有免疫應(yīng)答、黏膜免疫應(yīng)答及特異的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。國外包括課題組前期研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)c-di-AMP合成酶DisA、或敲除c-di-AMP分解酶的重組Mtb c-di-AMP水平均升高,能夠激活I(lǐng)型干擾素應(yīng)答,并誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬;c-di-AMP水平升高降低了重組Mtb的毒力,促進(jìn)了宿主對(duì)Mtb的清除。c-di-AMP被認(rèn)為是一種新型的病原體相關(guān)的分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)。因此,c-di-AMP成為細(xì)菌疫苗研究的靶點(diǎn)。目的構(gòu)建過表達(dá)Mtb c-di-AMP合成酶DisA的rBCG并研究其生物學(xué)特性;初步明確該rBCG對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用,明確該rBCG的免疫學(xué)特性并評(píng)價(jià)其對(duì)Mtb感染小鼠的免疫保護(hù)效率。方法和結(jié)果1.rBCG-DisA的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究以Mtb H37Rv基因組為模板,PCR擴(kuò)增1 100bp的Rv3586(disA)基因片段;亞克隆至大腸埃希菌-分枝桿菌過表達(dá)載體PW54,構(gòu)建包含disA基因的重組質(zhì)粒,命名為PW56。將PW56質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至BCG感受態(tài)細(xì)胞,PCR和Western blot鑒定重組菌,結(jié)果表明在BCG中成功表達(dá)43kDa的DisA,該重組菌株命名為rBCG-DisA。制備菌株核苷酸樣品,HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示,rBCG-DisA的c-di-AMP水平顯著升高(P0.05)。對(duì)BCG生物學(xué)特性研究表明,c-di-AMP水平升高不影響B(tài)CG的生長(zhǎng)速度。齊-尼抗酸染色結(jié)果表明過表達(dá)DisA不影響B(tài)CG抗酸特性及菌體排列。透射電鏡觀察及分析結(jié)果表明,c-di-AMP水平升高使BCG菌體長(zhǎng)度變短20.4%。2.rBCG-DisA對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用研究化學(xué)合成的c-di-AMP(10μg/mL)作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,檢測(cè)自噬相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平。qRT-PCR結(jié)果顯示,c-di-AMP可誘導(dǎo)自噬相關(guān)基因LC3、Beclin1、Atg5及Atg7轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(P0.01,P0.05,P0.05,P0.01)。BCG、rBCG-DisA感染RAW264.7巨噬細(xì)胞(MOI=10),自噬相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平也上調(diào),其中rBCG-DisA感染誘導(dǎo)Beclin1、Atg7表達(dá)上調(diào)更為顯著(P0.01,P0.05)。Western blot結(jié)果顯示,BCG、rBCG-DisA感染RAW264.7巨噬細(xì)胞均不影響LC3、p62蛋白表達(dá)水平;BCG、rBCG-DisA感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞不影響LC3蛋白表達(dá),但p62蛋白表達(dá)均顯著增加(P0.01,P0.01)。3.rBCG-DisA的免疫學(xué)特性研究將雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組:Na?ve、UN、BCG、rBCG-DisA組。對(duì)照組Na?ve和UN組分別皮下接種0.1mL PBS,免疫組BCG和rBCG-DisA組分別皮下接種細(xì)菌1×10~6CFU/只。每天觀察免疫小鼠飲水、進(jìn)食情況,每周稱量小鼠體重,結(jié)果表明BCG、rBCG-DisA免疫小鼠與對(duì)照組小鼠進(jìn)食和飲水無差異,各組小鼠體重均呈上升趨勢(shì),兩免疫組間小鼠體重?zé)o顯著差異(P0.05)。免疫完成后4w,ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清中特異性抗體水平,結(jié)果表明兩免疫組小鼠抗體水平均顯著升高(P0.05)。MTS檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖情況,結(jié)果顯示BCG菌體蛋白刺激后,兩免疫組淋巴細(xì)胞增殖顯著(P0.05,P0.05),DisA蛋白刺激后,rBCG-DisA組增殖更為顯著(P0.001)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4~+、CD8~+T細(xì)胞比例,結(jié)果顯示兩免疫組小鼠CD4~+和CD8~+T細(xì)胞的百分比、CD4~+/CD8~+比值與對(duì)照組小鼠相比無顯著變化(P0.05)。qRT-PCR檢測(cè)免疫小鼠肺臟、脾臟細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示兩免疫組小鼠脾臟、肺臟IFN-γ、IL-2和IL-10轉(zhuǎn)錄水平均顯著上升,rBCG-DisA組三種細(xì)胞因子升高更為顯著(P0.05),且rBCG-DisA組誘導(dǎo)的IFN-γ水平顯著高于BCG免疫組(P0.05)。ELISA檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子分泌,結(jié)果顯示兩免疫組脾淋巴細(xì)胞IFN-γ、IL-2、IL-10分泌均增加,其中rBCG-DisA組IFN-γ分泌增加更為顯著(P0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá),結(jié)果顯示rBCG-DisA組僅分泌TNF-α的CD4~+T細(xì)胞比例顯著增加(P0.05)。免疫完成后4w,小鼠尾靜脈感染Mtb H37Ra 5×10~4CFU/只。免疫小鼠經(jīng)Mtb感染后8w,檢測(cè)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。結(jié)果表明,兩免疫組小鼠Mtb感染后,體內(nèi)抗體水平進(jìn)一步升高,其中rBCG-DisA組顯著升高(P0.05);淋巴細(xì)胞增殖顯著(P0.01,P0.01);IFN-γ、IL-2、IL-10的轉(zhuǎn)錄水平均升高,且rBCG-DisA組與BCG組相比顯著升高(P0.01,P0.05,P0.05);rBCG-DisA免疫組Th1型和Th2型的細(xì)胞因子分泌均顯著增加,且IFN-γ、IL-2、IL-10分泌顯著高于BCG組(P0.01,P0.05,P0.05)。HE染色結(jié)果顯示,rBCG-DisA免疫組小鼠肺組織病理改變與BCG免疫組小鼠相似。平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)感染小鼠肺臟、脾臟荷菌數(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未免疫感染組(UN組)相比,兩免疫組小鼠肺臟、脾臟荷菌數(shù)均顯著降低(P0.01),兩免疫組間小鼠臟器荷菌數(shù)無顯著差異(P0.05)。結(jié)論本研究成功構(gòu)建了c-di-AMP水平升高的rBCG-DisA,證明c-di-AMP水平影響菌體長(zhǎng)度;c-di-AMP、rBCG-DisA可顯著誘導(dǎo)自噬相關(guān)基因表達(dá),且rBCG-DisA使自噬降解減少。rBCG-DisA免疫小鼠可誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答,及以IFN-γ表達(dá)升高為特征的Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。兩免疫組小鼠經(jīng)Mtb感染后,Th1和Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答水平均上升,其中rBCG-DisA免疫組顯著高于BCG組;rBCG-DisA免疫小鼠對(duì)Mtb感染具有保護(hù)作用,其保護(hù)作用和BCG免疫相當(dāng)。
【圖文】：

圖 1 已批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的 TB 疫苗[14]Figure 1 TB vaccines approved for clinical trialsMVA85A（ID/IM/Aerosol），為重組痘病毒 MVA85A（recombinant pox virus MVA85A）表達(dá) Ag85A 的病毒載體疫苗，用于初次免疫、加強(qiáng)免疫，或者感染后免疫治療[15]。③TB/FLU-04L，為表達(dá) Mtb 抗原Ag85A、早期分泌 6kDa靶抗原（early secreted antigentarget 6kDa，ESAT-6）的流感病毒載體（influenza virus vector）疫苗，該疫苗可表達(dá)抗原，但存在復(fù)制缺陷，不能在哺乳動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制[16]。（2） 亞單位疫苗 4 種：①H4:IC31，是 Ag85B、TB10.4 融合蛋白加入 IC31 佐劑組成的亞單位疫苗[17]。②H56:IC31 是由 Mtb 多階段抗原組成的亞單位疫苗，包括Mtb 早期抗原 Ag85B、ESAT-6 和潛伏感染抗原 Rv2660c 組成的融合蛋白，，再加入 IC31佐劑，用于初次免疫或者加強(qiáng)免疫[18]。③ID93+GLA-SE，包括 Mtb 四種抗原，分別是毒力因子 Rv2608、Rv3619、Rv3620 和潛伏感染相關(guān)因子 Rv1813，再加入 GLA-SE

菌、化膿性鏈球菌等致病菌中也都發(fā)現(xiàn)了 c-di-AMP 合成酶。隨后，在枯中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè) c-di-AMP 分解酶 YybT，其具有磷酸二酯酶（phosphodies）活性，可將 c-di-AMP 水解生成線性 pApA 分子。YybT 含有有磷酸二甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸（Gly-Gly-Asp-Glu-Phe，GGDE，將其與其他菌屬中的含有 GGDEF 結(jié)構(gòu)域的蛋白命名為 GGDEF 結(jié)構(gòu)（GGDEF domain protein containing PDE，GdpP）[61]。本室柏銀蘭等[8]首次報(bào)道 Rv3586 是 Mtb 中合成 c-di-AMP 的 DAC 酶，其與 DisA 相似。通過分析 Mtb 的基因組，發(fā)現(xiàn) Rv3586 是 Mtb 中惟一的 c-d酶。2014 年，又首次報(bào)道，Rv2837c 是 Mtb 中 c-di-AMP 的分解酶，且含-組氨酸-組氨酸（Asp-His-His，DHH）結(jié)構(gòu)域?qū)?CnpB 酶催化 c-di-AMP 不可少，將其命名為 CnpB（cyclic nucleotide phosphodiesterase，CnpB）[62di-AMP 水平受合成酶 Rv3586 和分解酶 Rv2837c 的精密調(diào)控，如圖 2 所
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2613300