【摘要】：研究背景及目的:肝癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因,是世界上最常見和惡性程度最高的腫瘤之一。全球每年有近85萬新發(fā)肝癌病例,我國新發(fā)例數(shù)和死亡例數(shù)量約占全球的50%以上。肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)作為原發(fā)性肝癌最主要的一種亞型,約占原發(fā)性肝癌的90%,在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。射頻消融(Radiofrequency ablation,RFA)是目前針對肝癌應(yīng)用最廣泛的熱消融治療技術(shù),也是肝癌微創(chuàng)治療的代表性介入治療方式。隨著射頻消融儀器設(shè)備的改進(jìn)及影像診療技術(shù)的不斷提高,射頻消融在HCC患者臨床治療中的地位日益顯著。環(huán)狀RNA(CircularRNAs,CircRNAs)是一種特殊類型的內(nèi)源性非編碼RNA,是一類不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴,并以共價鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子,已被證實(shí)參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。然而,circRNA在肝癌射頻消融中的表達(dá)譜仍然未知。本研究旨在從circRNA為切入點(diǎn),利用基因芯片技術(shù)從射頻消融的裸鼠肝癌移植瘤模型中篩選出差異性表達(dá)的circRNA,探討circRNA在射頻消融HepG2裸鼠肝癌移植瘤模型中可能的作用。材料和方法:1.裸鼠肝癌模型的建立對8只雄性免疫缺陷鼠(Balb/c裸鼠)(20±2g)脊柱側(cè)注射HepG2細(xì)胞100μl(2x10~6個/ml)進(jìn)行Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型建模。應(yīng)用二維超聲(Ultrasonic,US)、彩色多普勒(Color Doppler flow imaging,CDFI)檢查技術(shù)對HepG2裸鼠皮下移植瘤模型造模情況進(jìn)行評估。2.超聲引導(dǎo)下裸鼠射頻消融隨機(jī)平均分配實(shí)驗(yàn)組(N=4)和對照組(N=4),對實(shí)驗(yàn)組4只Balb/c裸鼠進(jìn)行仰臥位超聲引導(dǎo)下Cool-tip冷循環(huán)系統(tǒng)RFA不全消融(射頻功率30W,持續(xù)消融10s)。RFA后處死實(shí)驗(yàn)組及對照組裸鼠,立即(10min)取新鮮腫瘤組織并等分為2份(100mg),一份進(jìn)行病理學(xué)檢查,觀察腫瘤細(xì)胞;另一份腫瘤新鮮組織以磷酸緩沖鹽溶液清洗干凈,樣本立即橫置放入裝有5倍體積RNAlater保護(hù)液的凍存管中,隨即放入-80°C液氮中冷凍并送組織芯片測序。3.CircRNA芯片分析提取8例樣本的總RNA并對純度和濃度進(jìn)行定量。通過變性瓊脂糖凝膠電泳評估RNA完整性。對檢驗(yàn)合格的樣品使用Agilent Scanner G2505C進(jìn)行掃描,進(jìn)行Arraystar Human CircRNA Array v2檢測分析。使用R軟件limma軟件包進(jìn)行原始數(shù)據(jù)分位數(shù)歸一化和后續(xù)的circRNA差異表達(dá)數(shù)據(jù)處理。4.CircRNA實(shí)時熒光定量PCR(q PCR)驗(yàn)證選取差異上、下調(diào)的circ RNA分別施行實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)檢測,對本研究內(nèi)部芯片的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。5.CircRNA在HCC中的臨床表達(dá)通過大數(shù)據(jù)挖掘技術(shù),檢索Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫,回顧性分析基因芯片中circRNA在HCC中臨床組織樣本表達(dá)的病例對照研究。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較分析差異表達(dá)circRNA在HCC和相鄰癌旁組織的表達(dá)水平以及應(yīng)用Stata12.0進(jìn)行系統(tǒng)評價及異質(zhì)性分析,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差(Standardised mean differnece,SMD)、總受試者工作曲線(Summary receiver operator characteristic curve,SROC)及95%CI對GEO數(shù)據(jù)庫芯片合并統(tǒng)計(jì)量,對circRNA在HCC中的表達(dá)水平及診斷價值進(jìn)行評估。繪制漏斗圖及Egger回歸方程評估有無發(fā)表偏倚。結(jié)果:1.裸鼠肝癌模型的建立對HepG2裸鼠皮下移植瘤模型造模情況進(jìn)行評估。二維超聲(US)提示:于裸鼠背側(cè)脊柱旁皮下探及一低回聲團(tuán),病灶的大小約1.4x0.1cm、邊界尚清、形態(tài)不規(guī)則、內(nèi)回聲不均。CDFI彩色多普勒顯像提示病灶內(nèi)有較豐富血流信號。2.超聲引導(dǎo)下裸鼠射頻消融解剖未經(jīng)射頻消融對照組四只肝癌裸鼠,將腫瘤組織切開后,可見腫瘤組織由多個白色的結(jié)節(jié)樣團(tuán)塊組成。瘤體不與皮膚及皮下組織粘連,無明顯浸潤生長,易于剝離。HE染色病理切片鏡下示腫瘤細(xì)胞成索狀或片狀排列,細(xì)胞大小不一,可見多核瘤細(xì)胞,細(xì)胞核大深染,核分裂像增多,部分細(xì)胞胞質(zhì)豐富而紅染,細(xì)胞核呈圓形或卵圓形。射頻消融不全治療實(shí)驗(yàn)組裸鼠肝癌腫瘤組織不全毀損,將腫瘤組織切開后,肉眼可見瘤體表面呈白色燒灼樣。光鏡下見腫瘤細(xì)胞排列成小梁狀。腫瘤細(xì)胞體積大,呈多角形、圓形和柱狀,腫瘤細(xì)胞核漿比升高,細(xì)胞核深染,可見病理性核分裂象,可見片狀壞死。3.CircRNA芯片分析8例雄性Balb/c裸鼠的送檢瘤體組織標(biāo)本均符合CircRNA芯片質(zhì)量檢測的要求。對circRNA芯片檢測的原始數(shù)據(jù)歸一化和低表達(dá)信息進(jìn)行過濾后。通過RNA-seq技術(shù),散點(diǎn)圖和火山圖分析顯示共篩選到在未消融完全實(shí)驗(yàn)組和未消融對照組76個顯著差異表達(dá)的circRNA(21個差異性上調(diào)circRNA和55個差異性下調(diào)circRNA)(|FC|1.5,P0.05)。4.CircRNA實(shí)時熒光定量PCR(q PCR)驗(yàn)證對挑選的上調(diào)circRNA hsa_circRNA_103595和下調(diào)circRNA hsa_circRNA_001264分別行qPCR檢測,在實(shí)驗(yàn)組樣本中hsa_circRNA_103595上調(diào)1.926倍(P=0.037),hsa_circRNA_103595下調(diào)1.554倍(P=0.531)。與circRNA芯片的結(jié)果hsa_circRNA_103595上調(diào)1.528倍(P=0.001),hsa_circRNA_103595下調(diào)1.591倍(P=0.005)基本一致。5.CircRNA在HCC中的臨床表達(dá)基于GEO數(shù)據(jù)庫組織芯片,對21個差異性上調(diào)circRNA和55個差異性下調(diào)circRNA分別做HCC臨床組織樣本表達(dá)驗(yàn)證。GSE78520,GSE94508,GSE97332 3個芯片納入本次研究。在GSE94508芯片中,過表達(dá)的circRNA分別為hsa_circRNA_001264,hsa_circRNA_101225,hsa_circRNA_100139;低表達(dá)的circRNA分別為hsa_circRNA_100168和hsa_circ RNA_103392。在GSE97332芯片中,高表達(dá)的circRNA分別為hsa_circRNA_103666,hsa_circRNA_103595,hsa_circRNA_100139,hsa_circRNA_100505;低表達(dá)的circ RNA分別為hsa_circRNA_100168,hsa_circRNA_001264,hsa_circRNA_104733,hsa_circRNA_101225,hsa_circRNA_100308,hsa_circRNA_400101和hsa_circRNA_100065。通過對在三個芯片中均有表達(dá)數(shù)據(jù)的circRNA行合并效應(yīng)量,得到標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差(Standarised mean difference,SMD)的結(jié)果顯示,hsa_circRNA_100168在HCC中呈低表達(dá)(-2.089,95%CI:-2.089-(-3.447),P=0.003),其他circRNA的SMD均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.裸鼠肝癌模型的建立運(yùn)用HepG2瘤細(xì)胞活體種植法制作的裸鼠肝癌皮下移植瘤模型,該方法周期較短,成功率達(dá)100%。其生長行為與人類肝癌相似,適于施行腫瘤的實(shí)驗(yàn)性研究。2.超聲引導(dǎo)下裸鼠射頻消融與對照組相比,不全消融實(shí)驗(yàn)組裸鼠肝癌皮下移植瘤瘤體鏡下見殘留腫瘤細(xì)胞,術(shù)區(qū)片狀壞死,提示消融不完全�？尚泻罄m(xù)的超聲引導(dǎo)下裸鼠射頻消融circRNA表達(dá)譜研究。3.CircRNA測序分析本實(shí)驗(yàn)的不全消融裸鼠肝癌皮下移植瘤樣本中,circRNA表達(dá)發(fā)生了差異性變化。4.CircRNA實(shí)時熒光定量PCR(q PCR)驗(yàn)證PCR結(jié)果提示本研究內(nèi)部芯片的circRNA表達(dá)數(shù)據(jù)可靠。5.CircRNA在HCC中的臨床表達(dá)本研究內(nèi)部芯片的差異表達(dá)circRNA可能參與HCC的發(fā)生發(fā)展并發(fā)揮作用。在射頻消融HepG2裸鼠肝癌移植瘤樣本中,本研究證實(shí)了在射頻消融HepG2裸鼠肝癌移植瘤模型中circ RNA表達(dá)的改變,這可能在RFA后HCC患者的生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。這些發(fā)現(xiàn)不僅為研究RFA HCC的分子機(jī)制提供了新的方向,而且也為通過調(diào)控circRNA治療HCC提供了新的可能性。
【圖文】：

ure 2. RFA uses thermal energy to destroy tumor tissue and causes irreversible damage to tumor cing tumor cells.. RFA 利用熱能損毀腫瘤組織，引起腫瘤細(xì)胞的不可逆損傷，，從而殺滅腫瘤細(xì)胞。RFA 的臨床優(yōu)勢包括了低死亡率、局部治療、患者耐受重復(fù)治療等。研究也顯示 RFA 是 種安全有效的早期 HCC 線治療方案，接受 RFA者其 5 年生存率可達(dá) 67.9％[7]。Cool-tip 射頻消融系統(tǒng)可以用于原發(fā)

17Figure 3. Four possible looping patterns of circRNA.A. Lariat-driven circularization; B. Intron-pairing-driven circularization. C. Circular intronic RNA. D. RBPor trans-factor driven circularization. (Derived from “Qu S, Yang X, Li X, et al. Circular RNA: A new star ofnoncoding RNAs.[J] Cancer letters, 2015 Sep 1;365(2):141-8.”)圖 3.環(huán)狀 RNA 可能的 4 種成環(huán)模式。A. 套索驅(qū)動的環(huán)化; B. 內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化；C. 來源于內(nèi)含子； D. RNA 結(jié)合蛋白（RBP）或反式因素驅(qū)動的環(huán)化（源自“Qu S, Yang X, Li X, et al. Circular RNA: A new star of noncoding RNAs.[J] Cancer letters, 2015 Sep1;365(2):141-8.”）
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7;R445.1;R-332

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 ;Radiofrequency ablation,heat shock protein 70 and potential anti-tumor immunity in hepatic and pancreatic cancers:a minireview[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2010年04期

2 高進(jìn);裸鼠建立的過程及其在腫瘤異種移植中的作用(綜述)[J];國外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊);1981年02期

3 梁亞云;;裸鼠-人體腫瘤模型作為抗癌藥的一種預(yù)報(bào)性輔助篩選工具的評價[J];國外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊);1980年05期

本文編號：2611948