本文關鍵詞：旋毛蟲谷胱甘肽S-轉移酶的克隆表達及鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：谷胱甘肽S-轉移酶(Glutathione-S-transferase,GST)是一種具有解毒功能的酶,對各種有害的外源性化合物(如致癌物質和誘變劑)與細胞內源性化合物(如脂質過氧化合物)均有分解功能。GST在寄生蟲的抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用,它可以除去大部分的外源性和內源性的親電子化合物,有助于寄生蟲在宿主內的生存。GST蛋白酶在一些寄生蟲中已被鑒定并有所研究,如犬惡絲蟲、馬來絲蟲、日本血吸蟲、曼氏血吸蟲、肝片吸蟲及豬帶絳蟲等,但關于旋毛蟲GST的研究目前尚未見報道。本研究利用生物信息學分析了Ts GST與其它寄生蟲及模式生物GST的進化關系,應用分子克隆基因技術表達并純化了一種旋毛蟲谷胱甘肽轉移酶Ts GST,獲得r Ts GST蛋白及其免疫血清。通過SDS-PAGE和Western blot分析了該重組蛋白的抗原性及免疫原性,RT-PCR、Western blot及免疫熒光試驗(IFA)鑒定了Ts GST基因在旋毛蟲不同發(fā)育蟲期的轉錄、表達及其在蟲體的定位;觀察了r Ts GST免疫小鼠后的抗體應答類型及對宿主的免疫保護作用、免疫血清對旋毛蟲侵入腸上皮細胞(IEC)的影響及免疫血清介導的巨噬細胞對旋毛蟲的殺傷作用(ADCC)。運用生物化學方法分析了r Ts GST的酶活性及其最佳反應條件。本研究鑒定了r Ts GST的性質及其功能,為闡明旋毛蟲的侵入、生存及其與宿主小腸上皮細胞的相互作用和致病機制奠定基礎。材料與方法1.旋毛蟲蟲種、實驗動物及細胞系旋毛蟲(Trichinella spiralis)由鄭州大學基礎醫(yī)學院寄生蟲教研室昆明小鼠傳代保種。BALB/c小鼠、4-6周齡,購自河南省實驗動物中心。所用細胞系為小鼠腸上皮細胞(intestinal epithelial cells,IEC),是由本教研室分離培養(yǎng)。2.r Ts GST的免疫學分析將r Ts GST免疫BALB/c小鼠,獲得r Ts GST免疫血清,應用旋毛蟲感染小鼠血清及r Ts GST通過ELISA及Western blot鑒定r Ts GST的抗原性。3.Ts GST基因的轉錄、表達及定位收集旋毛蟲的感染性幼蟲、成蟲、新生幼蟲及肌幼蟲,提取總RNA進行RT-PCR,擴增Ts GST基因及內參基因GAPDH,檢測Ts GST基因的表達時相。收集小鼠感染旋毛蟲后3d與7d的成蟲,新生幼蟲及肌幼蟲,制備可溶性抗原進行Western blot,用r Ts GST免疫血清對不同蟲期的可溶性抗原進行識別,檢測Ts GST蛋白在不同蟲期是否有表達。收集旋毛蟲感染性幼蟲、3d與7d成蟲、新生幼蟲及肌幼蟲,IFA檢測r Ts GST免疫血清與旋毛蟲不同發(fā)育時期蟲體的反應性,觀察Ts GST蛋白在蟲體的定位。將收集的不同期蟲體進行石蠟包埋組織切片,通過IFA觀察Ts GST蛋白在不同時期蟲體的具體定位。4.r Ts GST蛋白的免疫保護性分析將60只BALB/c小鼠隨機分為3組(每組20只):分別為r Ts GST蛋白免疫組、佐劑及PBS對照組。按20μg蛋白/只小鼠的劑量進行皮下多點注射,每隔10 d免疫1次,共3次,末次免疫后10 d,每只小鼠經口攻擊感染300條旋毛蟲肌幼蟲。攻擊感染后7d每組各剖殺10只小鼠,回收腸道期成蟲并計算成蟲減蟲率,剩余小鼠感染后42 d剖殺,收集肌幼蟲并計算肌幼蟲減蟲率。同時收集小鼠免疫后不同時間血清,利用ELISA分析r Ts GST蛋白免疫小鼠所引起的免疫反應類型。5.r Ts GST免疫血清對旋毛蟲侵入IEC的影響及ADCC作用為了觀察r Ts GST免疫血清體外對旋毛蟲侵入IEC的影響,將r Ts GST免疫血清、感染后42 d小鼠血清及正常小鼠血清分別與半固體培養(yǎng)基按1:10混合,加入感染性幼蟲,覆蓋到IEC細胞表面,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2 h,觀察幼蟲侵入IEC細胞的情況,計算侵入率。將旋毛蟲肌幼蟲與小鼠腹腔巨噬細胞共同培養(yǎng),并加入不同濃度的重組蛋白免疫血清(1:5、1:50、1:100、1:200及1:500),37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至30h,觀察肌幼蟲存活的情況,計算死亡率,觀察r Ts GST免疫血清介導的抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)。6.Ts GST與寄生蟲及模式生物GST的進化關系分析在Gen Bank搜索并保存其它生物GST的氨基酸序列,利用MEGA6.0軟件構建進化樹,構建進化樹遵從最佳簡約原則,根據進化樹分析Ts GST與其他物種的進化關系。選取旋毛蟲屬中的本土旋毛蟲(T.nativa)和偽旋毛蟲(T.pseudospiralis)以及血吸蟲屬中的曼氏血吸蟲和日本血吸蟲的GST氨基酸序列,利用Clustal W軟件對氨基酸序列進行氨基酸序列的相似性分析。7.r Ts GST的酶活性及其性質分析GST具有催化還原性谷胱甘肽GSH與2,4二硝基苯CDNB結合的能力,其結合產物的光吸收峰值波長為340nm,通過測定340nm處吸光度上升速率,計算出GST的酶活力。r Ts GST酶在不同溫度和不同p H值的反應條件下,觀察該酶反應的最佳溫度和p H值,以及金屬離子與其他試劑對酶活性的影響。結果1.ELISA結果顯示,r Ts GST免疫血清與旋毛蟲可溶抗原產生陽性反應;Western blot發(fā)現(xiàn),抗r Ts GST血清可識別旋毛蟲可溶性抗原及純化的r Ts GST,均在24 k Da處顯示明顯條帶,表明r Ts GST具有較強的抗原性,且Ts GST是旋毛蟲可溶性抗原的組分。2.RT-PCR分析結果表明,Ts GST基因在旋毛蟲感染性幼蟲、成蟲、新生幼蟲和肌幼蟲4個時期均有表達;Western blot顯示Ts GST蛋白在旋毛蟲各個蟲期都有表達。IFA結果顯示,r Ts GST免疫血清能夠與旋毛蟲不同發(fā)育時期的蟲體發(fā)生陽性反應(顯現(xiàn)黃綠色熒光);蟲體組織切片IFA結果顯示Ts GST主要位于蟲體的皮層、桿狀體和生殖原基部位。3.r Ts GST蛋白免疫小鼠后可以產生抗Ts GST的高滴度抗體,誘導產生了以Th2免疫反應為主的免疫反應(表現(xiàn)為高水平的Ig G1)。旋毛蟲攻擊感染后,r Ts GST免疫小鼠的成蟲和肌幼蟲減蟲率分別為35.71%和38.55%。4.r Ts GST免疫血清體外對旋毛蟲侵入IEC具有明顯的抑制作用,r Ts GST免疫血清、感染血清及正常血清3組的幼蟲侵入率分別31.0%,11.36%及78.96%(χ2=46.4,P0.05)。ADCC實驗結果顯示,免疫血清組的蟲體死亡率70%,明顯高于正常血清組的12%(χ2=69.048,P0.001),蟲體死亡率具有抗體劑量依賴性(χ2=173.332,P0.001)。5.進化樹分析發(fā)現(xiàn),Ts GST與旋毛蟲屬中的本土旋毛蟲和偽旋毛蟲GST的進化最近,與人類GST的進化關系最遠。氨基酸序列相似性比對結果顯示,Ts GST氨基酸序列與本土旋毛蟲、偽旋毛蟲、曼氏血吸蟲及日本血吸蟲的GST氨基酸序列的相似度分別為60%、65%、31%、30%。6.r Ts GST生化性質分析結果顯示,純化后的r Ts GST蛋白具有GST酶活性,最適反應條件是溫度為40℃,p H 6.3 7.2。H2O2可完全抑制酶的活性,Mn2+和Na+離子可部分抑制酶的活性,Ca2+、Mg2+和K+離子對GST酶活性無明顯影響,但Ni2+離子可將酶活性增加54.7%。結論1.重組的Ts GST蛋白具有良好的抗原性及GST的酶活性;2.Ts GST在旋毛蟲不同發(fā)育期均有轉錄與表達,主要定位在蟲體的皮層、桿狀體和生殖原基;3.r Ts GST免疫血清在體外對旋毛蟲侵入IEC具有明顯的抑制作用,通過ADCC作用對肌幼蟲具有明顯的殺傷作用,表明GST是旋毛蟲幼蟲的侵入相關蛋白。
【關鍵詞】：旋毛蟲 谷胱甘肽轉移酶(GST) 侵入 腸上皮細胞 免疫保護
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;R383.15
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-17
• 英文縮略詞17-19
• 1 前言19-22
• 1.1 旋毛蟲感染引起的免疫應答19
• 1.2 谷胱甘肽S-轉移酶（Glutathione transferase，GST）的功能19-20
• 1.3 GST在寄生蟲感染中作用的研究20
• 1.4 研究的內容、目的和意義20-22
• 2 材料22-29
• 2.1 主要試劑22
• 2.2 主要儀器22-23
• 2.3 主要試劑的配制23-29
• 3 方法29-48
• 3.1 技術路線29
• 3.2 實驗動物、旋毛蟲蟲種及細胞系29-30
• 3.3 旋毛蟲各個蟲期的收集30
• 3.4 旋毛蟲肌幼蟲ES抗原與各個蟲期可溶性抗原的制備30-31
• 3.5 總RNA的提取31
• 3.6 cDNA反轉錄步驟31
• 3.7 引物設計31-32
• 3.8 目的基因PCR擴增32
• 3.9 重組基因克隆載體的構建與鑒定32-36
• 3.10 rTsGST的誘導表達36
• 3.11 rTsGST的SDS-PAGE分析36-37
• 3.12 rTsGST的可溶性分析37
• 3.13 rTsGST的純化37-38
• 3.14 rTsGST免疫血清的制備38
• 3.15 rTsGST的ELISA鑒定38-39
• 3.16 rTsGST的Western blot鑒定39-40
• 3.17 TsGST基因的轉錄與蛋白的表達鑒定40-41
• 3.18 TsGST蛋白在蟲體的具體定位41-43
• 3.19 旋毛蟲rTsGST蛋白小鼠體內實驗43-44
• 3.20 rTsGST免疫血清對旋毛蟲影響的體外實驗44-45
• 3.21 TsGST與其他寄生蟲和模式生物的進化關系45-46
• 3.22 rTsGST酶性質的鑒定46-47
• 3.23 統(tǒng)計學處理47-48
• 4 結果48-70
• 4.1 TsGST生物信息學分析48-50
• 4.2 引物設計50-51
• 4.3 旋毛蟲總RNA的提取51
• 4.4 TsGST基因的PCR擴增51-52
• 4.5 TsGST重組質粒的構建52-55
• 4.6 rTsGST蛋白的SDS-PAGE分析55-57
• 4.7 rTsGST在肌幼蟲ES和可溶抗原的免疫學分析57-59
• 4.8 TsGST基因的轉錄水平及翻譯水平鑒定59-60
• 4.9 rTsGST在裸蟲蟲體的表達及在組織中具體的定位60-61
• 4.10 rTsGST蛋白體內實驗結果61-64
• 4.11 rTsGST免疫血清對旋毛蟲影響的體外實驗64-65
• 4.12 rTsGST進化樹和序列比對分析65-67
• 4.13 rTsGST的生化性質分析67-70
• 5 討論70-73
• 5.1 谷胱甘肽S-轉移酶（GST）研究70
• 5.2 TsGST的生物信息學分析70
• 5.3 rTsGST的免疫原性和抗原性的鑒定70-71
• 5.4 rTsGST的體內體外實驗71-73
• 6 結論73-74
• 參考文獻74-78
• 綜述 旋毛蟲感染引起的免疫應答及谷胱甘肽S-轉移酶的研究78-90
• 參考文獻86-90
• 個人簡歷及碩士在讀期間發(fā)表的論文90-91
• 致謝91

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前2條

1 薛里;王愛德;;一種大量收集旋毛蟲新生幼蟲的簡便方法[J];中國寄生蟲病防治雜志;1993年01期

2 崔晶,王中全,張燈;旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌物中特異性診斷抗原的研究[J];中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志;2003年05期

  本文關鍵詞：旋毛蟲谷胱甘肽S-轉移酶的克隆表達及鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：261165