【摘要】：柯薩奇病毒A16型(coxsackievirus A16,CVA16)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬,是手足口病(hand foot and mouth disease,HFMD)的主要病原體之一。近年來發(fā)現(xiàn),CVA16感染的病患可引起腦部、肺部和心臟等的繼發(fā)感染,甚至還可能引發(fā)肺炎、心肌炎和難治性休克等致死性并發(fā)癥。大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)是細(xì)菌毒素,但是卻具有黏膜免疫佐劑活性,LT可以通過增加上皮細(xì)胞的滲透性和調(diào)節(jié)B細(xì)胞的分化,來誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng),以及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生和T細(xì)胞的形成。大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit,LTB),可作為特異性抗原的黏膜佐劑,用以增強特異性抗原的血清IgG抗體應(yīng)答。大腸桿菌Ⅱ型不耐熱腸毒素B亞單位(Escherichia coli type-Ⅱheat-labile enterotoxin B subunit,LT2B)具有比LTB更強的佐劑活性。目的:CVA16VP1與LT2B融合蛋白作為抗原的免疫原性的研究,初步評價產(chǎn)生的抗體的抗體效價,為進(jìn)一步研究柯薩奇病毒的新型疫苗奠定基礎(chǔ)。方法:本實驗利用DNA聚合酶對合成的CVA16VP1進(jìn)行擴增,得到大量的CVA16VP1基因片段,并引入BamH I和EcoR I兩個酶切位點,酶切后連入pET32a(+)大腸桿菌表達(dá)載體,構(gòu)建pET32-CVA16VP1表達(dá)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。設(shè)計引物對LTB擴增得到大量LT2B基因片段,并引入Sal I和Not I酶切位點,酶切后連入pET32-CVA16VP1,構(gòu)建pET32-CVA16VP1-LT2BO表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞。設(shè)計引物對pET32-CVA16VP1-LT2BO進(jìn)行全質(zhì)粒擴增,引入另一個Eco R I酶切位點,Eco R I單酶切PCR產(chǎn)物,自連得到pET32-CVA16VP1-LT2B表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞。通過質(zhì)粒PCR檢測,酶切檢測,測序檢測確定構(gòu)建的載體的正確性。在實驗室先前的研究基礎(chǔ)上,確定誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的最佳條件,然后進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá),通過Western-blot檢測目標(biāo)蛋白表達(dá)的正確性,采用His標(biāo)簽磁珠純化蛋白,TGE透析蛋白復(fù)性,聚乙二醇8000(PGE8000)對純化好的低濃度蛋白進(jìn)行濃縮,得到高純度濃度的CVA16VP1-LT2B融合蛋白。使用CVA16VP1-LT2B蛋白,通過滴鼻的方式免疫Balb/c小鼠,收集小鼠的血清,采用間接ELISA法檢測血清中特異性抗體IgG水平。結(jié)果:1.成功構(gòu)建了p ET32-CVA16VP1-LT2B融合表達(dá)載體,并成功轉(zhuǎn)入了BL21感受態(tài)細(xì)胞。2.在BL21中表達(dá)了帶有his標(biāo)簽的CVA16VP1-LT2B融合蛋白,Western-blot檢測到目的條帶,約為66KD左右。3.通過三次滴鼻免疫小鼠,獲得了小鼠血清,并利用Western-blot檢測,小鼠血清中有特異性抗體產(chǎn)生。4.間接ELISA檢測小鼠血清中特異性抗體效價結(jié)果顯示,CVA16VP1-LT2B具有一定的免疫原性,產(chǎn)生的抗體的抗體效價為1:800。結(jié)論:成功構(gòu)建的pET32-CVA16VP1-LT2B融合表達(dá)載體能夠表達(dá)具有免疫原性的融合蛋白,并且該融合蛋白是我們的目的蛋白。通過三次共28天的免疫小鼠,能夠獲得足夠的血清并能檢測出成功表達(dá)了特異性抗體。該抗體具的抗體效價能夠通過間接ELISA檢測出,為1:800。
【圖文】：

CR 鑒定 pET32-CVA16Ve PCR identification of pEL10000）；2：pET32-CV 測 序 結(jié) 果 正 確 ， 所達(dá)完整的 CVA16VP1-L 達(dá) 融 合 蛋 白 CVA驗過程中，通過不斷嘗T32-CVA16VP1-LT2B發(fā)現(xiàn)該載體中，LT2B1 2

經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白經(jīng)過 10% SDS-PAGE 電泳，Western 檢測如圖 2.1，蛋小約 66kDa。圖 2.1 his 標(biāo)簽鼠抗為一抗，，檢測 CVA16VP1-LT2BFigure 2.1 CVA16VP1-LT2B detection with his-tag mouse mAb.2 BCA 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及蛋白濃度測定結(jié)果橫坐標(biāo)為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，縱坐標(biāo)為吸光度，使用 EXCEL 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖 2.2，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算純化濃縮后蛋白的濃度。根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計 CVA16VP1-LT2B 融合蛋白濃度為 0.862μg/μl。——66kDa
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

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