【摘要】：研究背景:ECDI誘導(dǎo)的早期凋亡細胞已經(jīng)被作為有效且低毒性的免疫抑制方法應(yīng)用于治療自身免疫疾病的臨床研究,且在小鼠體內(nèi),可誘導(dǎo)胰島移植供體特異性免疫耐受形成,并且明顯延長同種異體心臟及皮片移植的存活時間。但與此同時,ECDI誘導(dǎo)的供體早期凋亡細胞相關(guān)免疫抑制機制仍不完全清楚。而M2型巨噬細胞作為非特異性免疫系統(tǒng)成員,在抑制炎癥反應(yīng),免疫抑制反應(yīng)中扮演重要的作用。研究目的:探索了供體ECDI-SPs與受體巨噬細胞極化方向的關(guān)系,揭示供體ECDI-SPs延長移植物存活時間的相關(guān)機制,為此方法進一步的臨床治療應(yīng)用提供了相應(yīng)理論基礎(chǔ)。研究方法:利用受體小鼠腹腔巨噬細胞(Mφ)與供體小鼠ECDI-SPs體外共培養(yǎng)體系,首先通過流式細胞術(shù),對受體巨噬細胞吞噬ECDI誘導(dǎo)的供體脾臟單個核細胞的吞噬情況進行了檢測,并進一步通過共培養(yǎng)體系,利用流式細胞術(shù)、RT-PCR以及Western Blot等技術(shù)對吞噬后受體巨噬細胞的極化方向、IL-10、IL-6等相關(guān)細胞因子的表達以及吞噬后極化方向改變的相應(yīng)分子機制進行了檢測。建立受體小鼠誘導(dǎo)極化后巨噬細胞與脾臟單個核細胞共培養(yǎng)體系,觀察極化后巨噬細胞對Treg細胞比例的影響。建立C57/BL6-Balb/c小鼠同種異體皮片移植模型,檢測在體情況下受體小鼠接受供體ECDI-SPs注射后,Mφ的極化方向與體外培養(yǎng)是否一致,同時檢測Treg比例,同時利用Luminex技術(shù)對小鼠血清相關(guān)炎癥及抑炎分子進行檢測。研究結(jié)果:受體小鼠Mφ可明確吞噬ECDI處理后供體小鼠脾臟細胞,且吞噬后向M2方向極化,與吞噬未經(jīng)處理的供體脾臟細胞極化方向截然相反。吞噬ECDI-SPs后受體Mφ的IL-10分子表達顯著上調(diào),同時IL-6等炎癥因子表達受到抑制。受體小鼠Mφ吞噬ECDI-SPs后,通過增強CREB的磷酸化,促進其自身向M2表型極化。誘導(dǎo)極化為M2型的巨噬細胞可進一步促進Treg細胞比例的上升。在體皮片移植模型情況下,與對照組相比,ECDI-SPs的注射同樣可促進受體小鼠體內(nèi)Mφ向M2型極化,且明顯提高了Treg細胞比例,且排斥終點血清IL-10明顯升高,同時IL-6、IL-12p70、IL-2、TNF-α、IFN-γ的水平明顯降低,最終延長了移植皮片的存活時間。研究結(jié)論:Mφ在吞噬同種異體ECDI處理的早期凋亡細胞后,通過增強CREB磷酸化,促進自身向M2方向極化,促進IL-10的分泌,抑制IL-6的生成,進一步提升Treg比例,調(diào)控移植排斥反應(yīng),延長移植物存活時間。
【圖文】：

1 小鼠脾臟淋巴細胞分離后分層情況示體淋巴細胞共培養(yǎng)體系的建立預(yù)先貼壁 C57BL/6 小鼠腹腔巨噬細胞中07個），各個孔分別加入 5×107個 分離得/c 小鼠脾臟單個核細胞以及 ECDI 誘導(dǎo)凋腔巨噬細胞對供體早期凋亡細胞的吞噬對脾臟單個核細胞進行 CFSE 染色。具0 的比例稀釋凍存的 2mmol/L 的 CFSE 儲度。重懸分離得到的小鼠脾臟單個核淋巴光染色 10min。反應(yīng)結(jié)束后，向單個核細冷的 RPMI1640 培養(yǎng)液（含 10%胎牛血

圖 2 腹腔巨噬細胞的吞噬檢測圖 A 為 C57 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬自體及供體 Balb/c 小鼠 SPs 及 ECDI-SPs 的情況，CFSE 與 F4/80 雙陽性的細胞可表示吞噬了脾臟細胞的巨噬細胞。圖 B 為腹腔巨噬細胞吞噬比例統(tǒng)計圖，ECDI 處理后，巨噬細胞的吞噬比例明顯上升。*P<0.05。圖 C 為巨噬細胞系 RAW264.7 對 SPs 及 ECDI-SPs 的吞噬情況。3.2 Fox-O1 Lysm Cre 條件性敲除小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能檢測Fox-O1 分子作為巨噬細胞分泌 IL-10 分子的上游調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)巨噬細胞吞噬及相關(guān)細胞因子分泌功能方面有一定影響。結(jié)合實驗室現(xiàn)有條件，即 Fox-O1 LysmCre 條件性敲除小鼠，我們對基因敲除小鼠的腹腔巨噬細胞進行了提取，并利用了同樣的共培養(yǎng)體系及方法，對其吞噬功能進行了檢測。與野生型小鼠相比，F(xiàn)ox-O1 LysmCre 條件性敲除小鼠對 ECDI-SPs 的吞噬功能有明顯的上調(diào)。但由于品系以及供體的復(fù)雜性，，我們進一步對基因敲除小鼠的選擇以及對照組的挑選進行了改進，選取 Cre+的條件敲除小鼠腹腔巨噬細胞作為實驗組，以同窩繁殖的 Cre-的條件敲除小鼠腹腔
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

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本文編號：2608174