【摘要】：研究背景:ECDI誘導的早期凋亡細胞已經(jīng)被作為有效且低毒性的免疫抑制方法應用于治療自身免疫疾病的臨床研究,且在小鼠體內,可誘導胰島移植供體特異性免疫耐受形成,并且明顯延長同種異體心臟及皮片移植的存活時間。但與此同時,ECDI誘導的供體早期凋亡細胞相關免疫抑制機制仍不完全清楚。而M2型巨噬細胞作為非特異性免疫系統(tǒng)成員,在抑制炎癥反應,免疫抑制反應中扮演重要的作用。研究目的:探索了供體ECDI-SPs與受體巨噬細胞極化方向的關系,揭示供體ECDI-SPs延長移植物存活時間的相關機制,為此方法進一步的臨床治療應用提供了相應理論基礎。研究方法:利用受體小鼠腹腔巨噬細胞(Mφ)與供體小鼠ECDI-SPs體外共培養(yǎng)體系,首先通過流式細胞術,對受體巨噬細胞吞噬ECDI誘導的供體脾臟單個核細胞的吞噬情況進行了檢測,并進一步通過共培養(yǎng)體系,利用流式細胞術、RT-PCR以及Western Blot等技術對吞噬后受體巨噬細胞的極化方向、IL-10、IL-6等相關細胞因子的表達以及吞噬后極化方向改變的相應分子機制進行了檢測。建立受體小鼠誘導極化后巨噬細胞與脾臟單個核細胞共培養(yǎng)體系,觀察極化后巨噬細胞對Treg細胞比例的影響。建立C57/BL6-Balb/c小鼠同種異體皮片移植模型,檢測在體情況下受體小鼠接受供體ECDI-SPs注射后,Mφ的極化方向與體外培養(yǎng)是否一致,同時檢測Treg比例,同時利用Luminex技術對小鼠血清相關炎癥及抑炎分子進行檢測。研究結果:受體小鼠Mφ可明確吞噬ECDI處理后供體小鼠脾臟細胞,且吞噬后向M2方向極化,與吞噬未經(jīng)處理的供體脾臟細胞極化方向截然相反。吞噬ECDI-SPs后受體Mφ的IL-10分子表達顯著上調,同時IL-6等炎癥因子表達受到抑制。受體小鼠Mφ吞噬ECDI-SPs后,通過增強CREB的磷酸化,促進其自身向M2表型極化。誘導極化為M2型的巨噬細胞可進一步促進Treg細胞比例的上升。在體皮片移植模型情況下,與對照組相比,ECDI-SPs的注射同樣可促進受體小鼠體內Mφ向M2型極化,且明顯提高了Treg細胞比例,且排斥終點血清IL-10明顯升高,同時IL-6、IL-12p70、IL-2、TNF-α、IFN-γ的水平明顯降低,最終延長了移植皮片的存活時間。研究結論:Mφ在吞噬同種異體ECDI處理的早期凋亡細胞后,通過增強CREB磷酸化,促進自身向M2方向極化,促進IL-10的分泌,抑制IL-6的生成,進一步提升Treg比例,調控移植排斥反應,延長移植物存活時間。
【圖文】：

1 小鼠脾臟淋巴細胞分離后分層情況示體淋巴細胞共培養(yǎng)體系的建立預先貼壁 C57BL/6 小鼠腹腔巨噬細胞中07個），各個孔分別加入 5×107個 分離得/c 小鼠脾臟單個核細胞以及 ECDI 誘導凋腔巨噬細胞對供體早期凋亡細胞的吞噬對脾臟單個核細胞進行 CFSE 染色。具0 的比例稀釋凍存的 2mmol/L 的 CFSE 儲度。重懸分離得到的小鼠脾臟單個核淋巴光染色 10min。反應結束后，向單個核細冷的 RPMI1640 培養(yǎng)液（含 10%胎牛血

圖 2 腹腔巨噬細胞的吞噬檢測圖 A 為 C57 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬自體及供體 Balb/c 小鼠 SPs 及 ECDI-SPs 的情況，CFSE 與 F4/80 雙陽性的細胞可表示吞噬了脾臟細胞的巨噬細胞。圖 B 為腹腔巨噬細胞吞噬比例統(tǒng)計圖，ECDI 處理后，巨噬細胞的吞噬比例明顯上升。*P<0.05。圖 C 為巨噬細胞系 RAW264.7 對 SPs 及 ECDI-SPs 的吞噬情況。3.2 Fox-O1 Lysm Cre 條件性敲除小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能檢測Fox-O1 分子作為巨噬細胞分泌 IL-10 分子的上游調控因子，在調節(jié)巨噬細胞吞噬及相關細胞因子分泌功能方面有一定影響。結合實驗室現(xiàn)有條件，即 Fox-O1 LysmCre 條件性敲除小鼠，我們對基因敲除小鼠的腹腔巨噬細胞進行了提取，并利用了同樣的共培養(yǎng)體系及方法，對其吞噬功能進行了檢測。與野生型小鼠相比，F(xiàn)ox-O1 LysmCre 條件性敲除小鼠對 ECDI-SPs 的吞噬功能有明顯的上調。但由于品系以及供體的復雜性，，我們進一步對基因敲除小鼠的選擇以及對照組的挑選進行了改進，選取 Cre+的條件敲除小鼠腹腔巨噬細胞作為實驗組，以同窩繁殖的 Cre-的條件敲除小鼠腹腔
【學位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392

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本文編號：2608174