【摘要】：肺炎克雷伯菌是臨床上常見的條件致病菌之一,可引起不同部位的院內(nèi)感染。碳青霉烯酶是一類可水解碳青霉烯類抗生素的β內(nèi)酰胺酶,包括Ambler分類中的A類、B類和D類。KPC是一種在全世界范圍內(nèi)廣泛傳播的A類酶,目前在腸桿菌、假單胞菌和不動桿菌中都有發(fā)現(xiàn),其中以肺炎克雷伯菌最為常見。本研究旨在探討我國臨床分離的產(chǎn)KPC酶的多藥耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥機制,對其含有的耐藥質(zhì)粒進行表型和基因結(jié)構(gòu)研究。第一章對臨床收集到的兩株產(chǎn)KPC多藥耐藥肺炎克雷伯菌0716和12181進行了深入研究。通過16S rDNA和肺炎克雷伯菌標示基因khe進一步核實鑒定細菌種屬,利用改良Carba NP法檢測碳青霉烯酶及其類型,PCR篩查碳青霉烯基因;通過接合轉(zhuǎn)移或電轉(zhuǎn)化得到產(chǎn)KPC的接合子或轉(zhuǎn)化子;利用二代DNA測序技術(shù)對質(zhì)粒全序進行測定,并對得到的質(zhì)粒進行精細分析。結(jié)果顯示,0716和12181均為產(chǎn)KPC的肺炎克雷伯菌,并得到接合子0716-KPC-EC600和電轉(zhuǎn)化子12181-KPC-TOP10。二代測序分別得到兩個攜帶bla_(KPC-2)的質(zhì)粒p0716-KPC和p12181-KPC。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)p0716-KPC和p12181-KPC的基因結(jié)構(gòu)很相似。它們的骨架區(qū)都含有兩個不同的復(fù)制子,并含有來自IncFIIK和IncFIIY的質(zhì)粒穩(wěn)定性區(qū)域,以及來自Inc FIIK的接合轉(zhuǎn)移相關(guān)區(qū)域。p0716-KPC和p12181-KPC含有三個相似的耐藥基因插入?yún)^(qū),分別為ΔTn6209、多藥耐藥區(qū)和bla_(KPC-2)區(qū),耐藥基因bla_(KPC-2)、mph(A)、strAB、aacC2、qacEΔ1、sul1、sul2和dfrA25都位于這些耐藥基因插入?yún)^(qū)。另外p0716-KPC還另含有兩個耐藥基因aphA1a和bla_(TEM-1)。結(jié)果表明,p0716-KPC和p12181-KPC都屬于新的IncFII亞型,呈現(xiàn)嵌合體結(jié)構(gòu),攜帶多種耐藥基因。第二章對來自連云港某醫(yī)院的產(chǎn)KPC多藥耐藥肺炎克雷伯菌675920進行深入研究,共得到兩個多藥耐藥質(zhì)粒p675920-1和p675920-2。分析結(jié)果顯示這兩個質(zhì)粒均為嵌合體結(jié)構(gòu)質(zhì)粒。p675920-1是由IncFII質(zhì)粒pHN7A8和IncR質(zhì)粒pKPC-LK30雜合構(gòu)成的嵌合體結(jié)構(gòu)質(zhì)粒,但在p675920-1的復(fù)制起始區(qū),IncR復(fù)制子突變?yōu)榧倩?不能正常表達,所以p675920-1為僅Inc FII復(fù)制子發(fā)揮功能的質(zhì)粒。p675920-2的骨架區(qū)呈現(xiàn)出一種馬賽克結(jié)構(gòu),主要由自身獨有的復(fù)制起始區(qū)及來自pKPYL2的質(zhì)粒穩(wěn)定維持區(qū)、來自pP10164-3的質(zhì)粒穩(wěn)定維持區(qū)、來自pK1HV的質(zhì)粒穩(wěn)定維持區(qū)和來自pKPYL2的接合轉(zhuǎn)移區(qū)組成。p675920-1和p675920-2攜帶大量的耐藥基因,介導(dǎo)對至少7類抗生素分耐藥,包括β內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類、磷霉素類、磺胺類、甲氧芐啶類和四環(huán)素類。這些耐藥基因和插入序列、轉(zhuǎn)座子等移動元件共同組成三個結(jié)構(gòu)較新的多藥耐藥區(qū),其中兩個位于p675920-1,另一個位于p675920-2。p675920-1和p675920-2共存導(dǎo)致肺炎克雷伯菌675920趨向于泛耐藥。第三章對2012-2016年間從我國五家醫(yī)院收集到的51株產(chǎn)KPC的肺炎克雷伯菌中攜帶bla_(KPC)的質(zhì)粒類型進行調(diào)查研究。選擇菌株1068、20049、12139和64917進行深入研究并得到其攜帶bla_(KPC)的質(zhì)粒全序。分析結(jié)果顯示,測序得到的四個質(zhì)粒均為與p675920-1及pCT-KPC類似的嵌合體結(jié)構(gòu)。這六個質(zhì)粒彼此間僅存在一些由于骨架區(qū)和外源插入?yún)^(qū)的插入或缺失導(dǎo)致的差異。這些質(zhì)粒都包含兩個主要的外源插入耐藥區(qū),分別為攜帶bla_(KPC-2)和bla_(SHV-12)的bla_(KPC-2)區(qū)及攜帶rmtB、fosA3、bla_(TEM-1B)和bla_(CTX-M-65)的多藥耐藥區(qū),但六個質(zhì)粒中這兩個耐藥區(qū)分別呈現(xiàn)出不同的進化路徑。對pHN7A8/pKPC-LK30嵌合體質(zhì)粒在產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌中的流行情況進行調(diào)查顯示,51株菌均包含此類質(zhì)粒。多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST)分析顯示,51株肺炎克雷伯菌均屬于CG258。因此包含攜帶耐藥基因bla_(KPC-2)和rmtB的pHN7A8/pKPC-LK30嵌合體結(jié)構(gòu)質(zhì)粒的肺炎克雷伯菌CG258克隆群菌株在我國的多家醫(yī)院均為克隆化傳播。綜上所述,本研究中攜帶bla_(KPC)的質(zhì)粒均為IncFII型別的嵌合體結(jié)構(gòu)質(zhì)粒,且均攜帶大量的耐藥基因。質(zhì)粒上各種抗菌藥物抗性基因的積累是由于在多種抗菌藥物的選擇壓力下各種復(fù)雜的移動元件水平轉(zhuǎn)移事件導(dǎo)致的。細菌一旦獲得這些多藥耐藥質(zhì)粒就對多種抗菌藥物產(chǎn)生抗性,并導(dǎo)致臨床治療中可選擇的抗生素大大減少,最終引起死亡率上升。
【圖文】：

第 4 頁圖 1 blaKPC結(jié)構(gòu)線性比較圖注：箭頭代表基因，不同顏色表示不同功能；此圖引自“Complete sequences ofKPC-2-encoding plasmid p628-KPC and CTX-M-55-encoding p628-CTXM coexisted in Klebsiepneumoniae”[22]Fig 1. Linear comparison of blaKPC-2genetic surroundingsNote: Genes are denoted by arrows and colored based on gene function classification.blaKPC位于不同型別的質(zhì)粒上，包括 IncF、IncI、IncA/C、IncN、IncX、IncRncP、IncU、IncW、IncL/M 和 ColE 型質(zhì)粒，這些質(zhì)粒的大小范圍為 10 300 kb[27]

合抗感染治療 8 天，但病情未有改善，治療微生物分析儀鑒定為肺炎克雷伯桿菌，藥敏林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦、一二三四氨曲南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因2181 的 16S rDNA 測序及比對結(jié)果顯示均為標識基因 khe 為陽性，，因此判定兩株菌均為AST 比對結(jié)果見表 1.11，khe 擴增電泳結(jié)果表 1.11 菌株 16S rDNA 基因 BLAST 比對Tab 1.11 Results of BLAST alignment of 16S 菌種名 覆蓋度 相似度 Gbsiella pneumoniae 100% 100% bsiella pneumoniae 100% 100%
【學位授予單位】：軍事科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R378

【參考文獻】

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 馮嬌;質(zhì)粒介導(dǎo)的多重耐藥弗氏檸檬酸桿菌耐藥機制研究[D];吉林大學;2015年

本文編號：2608030