【摘要】：目的通過對(duì)華支睪吸蟲半胱氨酸蛋白酶(CsCysP38.3)功能和特性的研究,分析其在蟲體與宿主之間所起作用,評(píng)價(jià)CsCysP38.3作為候選診斷抗原的價(jià)值和候選疫苗分子的可能性。方法根據(jù)GenBank上華支睪吸蟲半胱氨酸蛋白酶基因(DQ902586.1)序列設(shè)計(jì)合成2對(duì)特異引物,提取華支睪吸蟲成蟲總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得目的基因(CsCysP38.3);將目的基因與原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28aCsCysP38.3,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21大腸桿菌中進(jìn)行目的蛋白表達(dá),并對(duì)獲得重組蛋白Cs CysP38.3(rCs CysP38.3)進(jìn)行純化和復(fù)性。熒光免疫組化方法觀察CsCys P38.3在華支睪吸蟲成蟲、后尾蚴和囊蚴階段的組織定位。以rCsCysP38.3作為抗原,ELISA方法檢測(cè)華支睪吸蟲病人血清中特異IgG亞類和IgE,檢測(cè)IgG1和IgG4檢出率及交叉反應(yīng)。用rCsCysP38.3免疫SD大鼠,在特異抗體滴度最高時(shí)進(jìn)行囊蚴感染,通過計(jì)數(shù)大鼠糞便中蟲卵數(shù)及成蟲數(shù)來評(píng)價(jià)免疫保護(hù)作用。結(jié)果成功構(gòu)建了pET-28a-CsCysP38.3重組質(zhì)粒,原核表達(dá)產(chǎn)物rCsCysP38.3經(jīng)純化、復(fù)性后獲得濃度為750μg/mL可溶性蛋白。熒光免疫組化結(jié)果顯示CsCysP38.3在成蟲定位于腸支,在后尾蚴定位于腸道、皮層和皮層細(xì)胞,在囊蚴定位于皮層和皮層細(xì)胞。rCsCysP38.3檢測(cè)華支睪吸蟲病人血清以IgG1和IgG4為主,特異IgG1檢出率為33.3%(8/24例),IgG4檢出率為58.3%(14/24例),主要與血吸蟲和肺吸蟲有交叉反應(yīng)。rCsCysP38.3免疫大鼠后特異性IgG水平顯著升高,至初次免疫后6周達(dá)高峰,效價(jià)高達(dá)1:1638400;在囊蚴感染后,免疫組與對(duì)照組的EPG(每克糞便蟲卵計(jì)數(shù))和寄生膽管成蟲數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無顯著性差異,顯示經(jīng)rCsCysP38.3免疫后無明顯抗蟲感染的免疫保護(hù)作用。結(jié)論1.CsCysP38.3在成蟲、后尾蚴定位顯示該半胱氨酸蛋白酶可能參與了營養(yǎng)代謝功能,在囊蚴的定位提示可能與成囊和脫囊有關(guān)。2.rCsCysP38.3檢測(cè)華支睪吸蟲病人血清中特異IgG4效果尚可,可作為候選診斷抗原。3.rCsCysP38.3對(duì)囊蚴感染的免疫保護(hù)作用不明顯。4.rCsCysP38.3具有較好的抗原性和免疫原性。
【圖文】：

模板的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物（1ith adult cDNA. M, markDL組質(zhì)粒雙酶切鑒定（1.0%組質(zhì)粒雙酶切后；3，，pET2ducts and identification of rec0; Lane1, PCR produces; La; Lane3, pET28a digested by

21 1-2 PCR 產(chǎn)物及重組質(zhì)粒雙酶切鑒定（1.0%瓊脂糖凝膠電泳PCR 產(chǎn)物；2，重組質(zhì)粒雙酶切后；3，pET28a 空質(zhì)粒雙酶切fication by PCR products and identification of recobinant plasmid bme. M, mark DL2000; Lane1, PCR produces; Lane2, recobinant plrestriction enzymes; Lane3, pET28a digested by restriction enzyme
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R383.22

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2605603