【摘要】：目的前期研究結(jié)果顯示順鉑誘導(dǎo)的腎損傷大鼠模型中miR-146b表達(dá)上調(diào),而間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)移植后下調(diào),提示MSC能降低miR-146b表達(dá)而對(duì)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷起保護(hù)、修復(fù)作用。結(jié)合臨床腎病患者血清miR-146b較健康人表達(dá)明顯上升,預(yù)測(cè)miR-146b可能成為腎損傷的早期分子標(biāo)志物之一。在此基礎(chǔ)上,本課題構(gòu)建了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cell,hucMSC-exosomes)介導(dǎo)的小鼠膿毒癥相關(guān)急性腎損傷修復(fù)模型,揭示miR-146b在膿毒癥相關(guān)急性腎損傷中的作用及機(jī)制,并檢測(cè)臨床不同病因?qū)е碌募毙阅I損傷患者AKI早期血清miR-146b水平,以評(píng)估其作為AKI早期診斷標(biāo)志物的應(yīng)用價(jià)值。方法盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)法構(gòu)建小鼠膿毒癥相關(guān)急性腎損傷模型(CLP模型),以假手術(shù)組(Sham組)為對(duì)照組,修復(fù)組(hucMSC-exosomes組)術(shù)后腹腔注射hucMSC-exosomes,損傷組(CLP組)術(shù)后腹腔注射等量PBS。收集術(shù)后Oh、24h各組小鼠的血清標(biāo)本及24h各組小鼠的腎臟標(biāo)本,結(jié)合小鼠癥狀表現(xiàn)及腎功能(血清肌酐、尿素氮)變化、組織病理學(xué)結(jié)果驗(yàn)證造模成功。PCNA免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組腎組織細(xì)胞增殖能力,Western Blot分析增殖凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3的表達(dá),綜合判斷hucMSC-exosomes對(duì)膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的損傷腎組織的保護(hù)及修復(fù)作用。通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)各組腎組織中miR-146b的表達(dá)水平,探討膿毒癥相關(guān)急性腎損傷中miR-146b的反應(yīng)性。結(jié)合大量文獻(xiàn)資料,預(yù)測(cè)miR-146b在hucMSC-exosomes介導(dǎo)的小鼠膿毒癥相關(guān)急性腎損傷修復(fù)中作用的靶基因IRAK1和TRAF6,qRT-PCR檢測(cè)模型中各組腎組織中IRAK1和TRAF6及下游NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,初步揭示miR-146b在hucMSC-exosomes介導(dǎo)的小鼠膿毒癥相關(guān)急性腎損傷修復(fù)中的作用機(jī)制。針對(duì)不同臨床病因?qū)е碌募毙阅I損傷患者的血清標(biāo)本進(jìn)行分類預(yù)收集,Taq-man qRT-PCR檢測(cè)確診AKI患者明確診斷前至少3天的血清中miR-146b及血清肌酐、尿素氮的表達(dá)水平,評(píng)估m(xù)iR-146b在臨床早期診斷AKI中的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果模型中各組的血清肌酐和尿素氮水平及腎組織切片HE染色結(jié)果表明,利用CLP法可成功構(gòu)建小鼠膿毒癥相關(guān)急性腎損傷模型,PCNA免疫組織化學(xué)染色及Western Blot結(jié)果顯示hucMSC-exosomes能刺激損傷的腎組織細(xì)胞增殖再生,并減弱受損腎組織細(xì)胞的凋亡。此外,miR-146b在膿毒癥相關(guān)的急性腎損傷的損傷腎組織較正常組織中的表達(dá)無明顯變化,而在經(jīng)hucMSC-exosomes修復(fù)后的腎組織中表達(dá)明顯上調(diào)(P0.001)。qRT-PCR結(jié)果顯示IRAK1基因和TRAF6基因的相對(duì)含量損傷時(shí)明顯升高,而hucMSC-exosomes修復(fù)后又顯著下降,與miR-146b的變化反向一致。Western blot顯示了與qRT-PCR同樣的結(jié)果。免疫組化染色結(jié)果顯示損傷組NF-κB抑制蛋白αIKBα(IKBα)、磷酸化NF-κB抑制蛋白α(pIKBα)、NF-κB蛋白p65和p-p65(磷酸化NF-κB蛋白p65)一致表達(dá)升高,修復(fù)時(shí)IKBcα表達(dá)進(jìn)一步升高而pIKBα、p65和p-p65表達(dá)有所回降。qRT-PCR結(jié)果表明TNF-α和IL-1p的mRNA表達(dá)水平在損傷組表達(dá)顯著升高而在修復(fù)組有所下降但仍高于假手術(shù)組(PO.OOl)。收集的53例不同病因的確診AKI患者血清標(biāo)本,67.9%(36例)的血清標(biāo)本檢測(cè)到hs-miR-146b-5p有2倍到50倍以上不同程度的表達(dá)升高,其中腎前性AKI患者5例,腎性AKI患者30例,膿毒癥相關(guān)AKI患者1例。且血清中hs-miR-146b-5p的變化較血清肌酐和尿素氮提前了至少24h。結(jié)論CLP模型中,hucMSC-exosomes表現(xiàn)出同其他類型急性腎損傷模型中相似的修復(fù)作用,但其miR-146b的表達(dá)與其他類型急性腎損傷模型不一致,提示其可能在膿毒癥相關(guān)急性腎損傷中有不同于其他類型急性腎損傷的調(diào)節(jié)作用。miR-146b通過抑制IRAK1基因和TRAF6基因抑制NF-κB的活化進(jìn)而抑制炎性損傷而在hucMSC-exosomes介導(dǎo)的膿毒癥相關(guān)急性腎損傷修復(fù)中發(fā)揮作用。miR-146b在不同病因?qū)е碌募毙阅I損傷中有不同程度的表達(dá)升高,該變化比血清肌酐和尿素氮升高提前了至少24h,提示miR-146b可作為不受病因干擾的普遍敏感的急性腎損傷早期診斷標(biāo)志物應(yīng)用于臨床。
【圖文】：

圖 1. 1 m iR - 1 46 b 調(diào) 控的 主 要 信號(hào) 通 路及 作 用機(jī) 制 F ig u r e 1. 1 Ma i n s ig n a l pa t h w ay s an d m ec ha n i s m s o f m iR - 14 6b r eg u l a t i on 1 .2 急 性腎 損 傷 1. 2. 1 急性 腎 損 傷診 斷 標(biāo)準(zhǔn) 、 病 因及 治 療 20 0 5 年急 性腎 損 傷網(wǎng) 絡(luò)（A K IN ）制定 的 新急 性 腎損 傷 共識(shí) 將 急性 腎 損傷 （ ac u t e k id n e y in j u r y ，A K I ）定 義 為 ：3 個(gè) 月以 內(nèi) 出 現(xiàn) 的血 、 尿 、 組 織檢 測(cè) 或影 像學(xué) 等 方面 的 腎臟 功 能 或 結(jié)構(gòu) 異 常。 20 1 2 年 K DI G O 指 南確 立 了最 新的 AK I 診 斷標(biāo) 準(zhǔn) ：4 8 小時(shí) 內(nèi)血 清 肌酐 水 平 升 高 ≥0 .3 m g / d l （≥ 26 . 5 μm o l/ L ）或 超 過基 礎(chǔ) 值的 1 .5 倍 及以 上 ，且 明 確 或經(jīng) 推 斷上 述 情況 發(fā) 生在 7 天之 內(nèi) ； 或持 續(xù) 6 小時(shí) 尿 量＜ 0 . 5m l / （k g ·h ）[4 7 ] 。依 據(jù) 引 起急 性 腎損 傷 的 原因 可 分 為腎 前性 AK I （ 手術(shù) 、燒 傷 等致 血容 量 急劇 減少 ） 、腎 性 AK I（ 腎 毒性 藥 物如 呋塞 米 、甘 露醇 、氨 基 糖苷 類 ， 最 常 見， 占 4 0% ） 和 腎 后 性 AK I （各 種 原 因 引起 的 急性 尿 路梗 阻 ，

患 者 的 mi R - 14 6b 表 達(dá) 水 平[6 5 ] ，， 發(fā) 現(xiàn) 臨 床 腎水 平顯 著 性 高于 健 康人 ， 且 血清 mi R - 14 6 b 較肌 實(shí) 驗(yàn)和 體 外實(shí) 驗(yàn) 兩方 面 證 實(shí) 了 mi R - 1 46 b 作為 A性 。 對(duì)轉(zhuǎn) 染了 mi R - 14 6b 抑 制劑 的 N RK - 5 2E 細(xì) 胞進(jìn) l o t 檢測(cè) 證 明了 er b B 4 是 mi R - 14 6 b 的直 接 靶基 因 在 mi R - 14 6b 敲 減細(xì) 胞 中 顯著 高 表達(dá) ； 隨 后又 構(gòu) 建We s t e r n Bl o t 結(jié)果 顯示 er b B 4 下游 相 關(guān)蛋 白 st a t 5 [6 5 ] 。因 而 推 測(cè)出 mi R - 14 6b 在 順鉑 誘 導(dǎo) 的急 性 腎 本 課題 將 在 前期 研 究基 礎(chǔ) 上探 討 mi R N A1 46 b 在 關(guān)急 性 腎 損 傷體 外 模 型 中的 作 用 及 機(jī)制 并 評(píng) 估 其
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R459.7;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2604757