【摘要】：背景:骨再生一直是骨科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題,有效的骨再生治療依然存在巨大臨床需求。隨著組織工程研究的逐漸深入,間充質(zhì)干細(xì)胞在組織再生中的重要性得到了越來(lái)越多的關(guān)注。骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)因其獲取方法方便而較為常用,有研究指出,MSCs的上清液同樣有修復(fù)受損組織的功能,其作用可能與干細(xì)胞通過(guò)旁分泌囊泡調(diào)節(jié)靶細(xì)胞功能有關(guān)。外泌體(Exosome)作為干細(xì)胞旁分泌成分之一,在干細(xì)胞調(diào)節(jié)靶細(xì)胞功能中起到了十分重要的作用。外泌體一般直徑為40-160 nm,其內(nèi)包含源細(xì)胞內(nèi)合成的mRNA、miRNA、酶等成分,通過(guò)出芽的方式進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì),被靶細(xì)胞內(nèi)吞后釋放內(nèi)部成分,完成細(xì)胞間的通訊和信息交流。外泌體可以有效修復(fù)受損的組織、器官如心、肺、腎、腦等,說(shuō)明移植外泌體可以發(fā)揮移植干細(xì)胞類似的作用。因此我們推測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體(BMSC-Exos)能表現(xiàn)出與BMSC相似的生物學(xué)功能,即促進(jìn)骨再生。本課題將研究BMSC-Exos對(duì)骨再生的促進(jìn)作用,并初步探索骨再生的機(jī)制,希望能為將來(lái)外泌體治療骨再生提供理論依據(jù),也為臨床解決骨再生的提供新的線索和思路。目的:本研究旨在檢測(cè)骨髓間充干細(xì)胞外泌體(BMSC-Exos)的特征,并通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其促進(jìn)成骨分化的能力,同時(shí)探討其促進(jìn)骨再生的機(jī)制。方法:(1)原代培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),并對(duì)其表面抗原和多系分化潛能進(jìn)行鑒定;(2)收集BMSC的P4-P6代細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)上清液,通過(guò)試劑盒法提取BMSC-Exos;(3)透射電鏡觀察BMSC-Exos的形態(tài)結(jié)構(gòu),免疫電泳檢測(cè)BMSC-Exos的表面抗原;(4)茜素紅、ALP染色驗(yàn)證BMSC-Exos在體外促進(jìn)成骨分化能力;(5)通過(guò)大鼠顱骨缺損動(dòng)物模型驗(yàn)證BMSC-Exos在體內(nèi)促進(jìn)骨再生的能力;(6)通過(guò)免疫電泳和qRT-PCR檢測(cè)加入BMSC-Exos后的成骨細(xì)胞中相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)情況。結(jié)果:(1)分離培養(yǎng)的BMSCs形態(tài)呈多角形或長(zhǎng)梭形,表面抗原CD90、CD29、CD44為陽(yáng)性,符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。(2)BMSC-Exos呈雙面凹的圓形或橢圓形,直徑約40~120nm(81.7±19.9),表面抗原與BMSC一致。(3)經(jīng)茜素紅染色和ALP染色后,Exo組染色強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組,且染色強(qiáng)度與Exo濃度呈正相關(guān)。(4)通過(guò)對(duì)大鼠顱骨缺損模型拍攝X片、組織學(xué)分析,外泌體組的骨缺損修復(fù)情況優(yōu)于對(duì)照組,且有更多新生骨的形成。(5)免疫電泳顯示經(jīng)外泌體處理后,MSC細(xì)胞中的OCN、Runx2、β-catenin蛋白含量增加,qRT-PCR結(jié)果顯示Runx2、β-catenin的基因表達(dá)上調(diào)。結(jié)論:BMSC-Exos有促進(jìn)骨再生的能力,并與上調(diào)Wnt/β-catenin通路有關(guān)。
【圖文】：

BMSC 傳代細(xì)胞形態(tài)：呈多角形或長(zhǎng)梭形，細(xì)胞核大，形態(tài)均MSC 表面抗原表達(dá)情況：選擇 P4 代 BMSC 細(xì)胞進(jìn)行表析 BMSC 細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物。結(jié)果顯示，高表達(dá) CDMSC 標(biāo)志物，低表達(dá) CD34、CD45 等標(biāo)志物（表 1）。MSC 符合間充質(zhì)干細(xì)胞特征。表 1：BMSC 細(xì)胞表面標(biāo)志物表面抗原 BMSC 百分比（%CD29 97±0.43CD44 98±0.22CD90 98±0.78CD34 -CD45 -SC 多系分化潛能鑒定：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 3w 后進(jìn)行茜素紅

圖 2：BMSC 分別經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后，，茜素紅染色（左）和油紅 O 染色（右均呈陽(yáng)性。2.2.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體（BMSC-Exos）的特征（1）BMSC-Exos 形態(tài)學(xué)特征：TEM 下觀察外泌體呈兩面凹的橢圓形或形，直徑 40~120nm（81.7±19.9），有完整的磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：2604374