【摘要】：目的:小RNA SbfR是本課題組通過Solexa高通量測序技術(shù)首次在傷寒沙門菌中發(fā)現(xiàn)的一個非編碼RNA,相關(guān)分子特性分析結(jié)果顯示,SbfR可能是一反式編碼RNA。本論文旨在初步探索SbfR在傷寒沙門菌中發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用和機(jī)制,為后續(xù)研究SbfR靶基因及作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法:1.傷寒沙門菌轉(zhuǎn)錄組分析:將SbfR缺陷株(ΔSbfR+p BAD)和SbfR回補(bǔ)株(ΔSbfR+p BAD-SbfR)培養(yǎng)至對數(shù)期(OD600≈0.4),加入L-阿拉伯糖誘導(dǎo)后提取細(xì)菌總RNA,加入熒光素進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,標(biāo)記后的c DNA與全基因組芯片雜交,掃描并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,比較SbfR缺陷株和回補(bǔ)株基因表達(dá)譜差異。選擇部分差異表達(dá)基因進(jìn)行q RT-PCR,驗(yàn)證基因芯片結(jié)果。2.q RT-PCR分析基因表達(dá):分別提取各菌株總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為c DNA,進(jìn)行q RT-PCR實(shí)驗(yàn),檢測基因的m RNA水平。3.細(xì)菌在不同溫度下的生長曲線測定:分別在37°C和42°C培養(yǎng)SbfR缺陷株和回補(bǔ)株,每隔1h檢測OD600值,以O(shè)D600數(shù)值作縱坐標(biāo),以時(shí)間作橫坐標(biāo),繪制SbfR缺陷株和回補(bǔ)株的生長曲線,比較SbfR對細(xì)菌在兩種溫度下生長情況的影響。4.SbfR片段分部回補(bǔ)株構(gòu)建:分別構(gòu)建連有SbfR前69nt和后69nt片段的重組載體,所用質(zhì)粒為p BAD/Myc-His A,并將重組載體電轉(zhuǎn)入ΔSbfR,制備前69nt和后69nt SbfR片段回補(bǔ)株。5.細(xì)菌動力實(shí)驗(yàn):將空載體株(WT+p BAD)、SbfR缺陷株、SbfR回補(bǔ)株及SbfR片段分部回補(bǔ)株分別培養(yǎng)至對數(shù)期,用接種針蘸取菌液點(diǎn)種于LB半固體動力板,置于37°C孵箱過夜,測量細(xì)菌圈直徑,分析SbfR對細(xì)菌動力的影響。6.Western-blot檢測Flj B表達(dá)水平:將空載體株、SbfR缺陷株和SbfR回補(bǔ)株培養(yǎng)至對數(shù)期,收集全菌蛋白,用兔抗Flj B抗血清進(jìn)行Western-blot實(shí)驗(yàn),檢測各菌株Flj B表達(dá)水平。7.He La細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):將空載體株、SbfR缺陷株和SbfR回補(bǔ)株培養(yǎng)至對數(shù)期,與He La細(xì)胞共孵育90min,棄去培養(yǎng)液。一半細(xì)胞孔中加入Triton裂解細(xì)胞,涂板培養(yǎng),計(jì)數(shù)菌落數(shù)為粘附水平;一半細(xì)胞孔中加入慶大霉素培養(yǎng)90min后,加入Triton裂解細(xì)胞,涂板培養(yǎng),計(jì)數(shù)菌落數(shù)為侵襲水平。8.生物膜形成實(shí)驗(yàn):在TSB培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)空載體株、SbfR缺陷株、SbfR回補(bǔ)株及SbfR片段分部回補(bǔ)株至對數(shù)期,轉(zhuǎn)種至96孔板,30°C靜置4天,洗去浮游細(xì)菌并用結(jié)晶紫對生物膜染色,30%冰醋酸洗脫后595nm比色測定。結(jié)果:1.基因芯片分析結(jié)果顯示,SbfR缺陷株與回補(bǔ)株之間共99個基因表達(dá)水平存在差異;q RT-PCR結(jié)果與基因芯片分析數(shù)據(jù)相比,基因變化趨勢一致。2.生長曲線測定結(jié)果表明,在37°C條件下SbfR缺陷株與回補(bǔ)株的生長情況一致,而在42°C條件下回補(bǔ)株的生長明顯慢于缺陷株。3.成功構(gòu)建SbfR前69nt片段和后69nt片段的回補(bǔ)株(ΔSbfR+p BAD-F69,ΔSbfR+p BAD-L69)。4.動力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與空載體株相比,SbfR缺陷株動力下降,回補(bǔ)株動力恢復(fù);兩部分SbfR片段回補(bǔ)株動力均恢復(fù)到空載體株水平,且與SbfR全長回補(bǔ)株動力水平一致。5.與空載體株相比,SbfR缺陷株Flj B表達(dá)水平下降,回補(bǔ)株Flj B表達(dá)水平恢復(fù)。6.與空載體株相比,SbfR缺陷株對He La細(xì)胞的侵襲能力下降,回補(bǔ)株的侵襲能力恢復(fù)。7.與空載體株相比,SbfR缺陷株的生物膜形成能力下降,回補(bǔ)株的形成能力恢復(fù)。兩部分SbfR片段回補(bǔ)株生物膜形成能力均部分恢復(fù),與空載體株水平一致,但比SbfR全長回補(bǔ)株弱。8.SbfR缺陷株hsl S、hsl T、htp G、fli A、flj B、sop E等基因的轉(zhuǎn)錄水平低于SbfR回補(bǔ)株;flh D的轉(zhuǎn)錄水平高于SbfR回補(bǔ)株;prg J、fim A、csg A、yih P、rfa D、bcs A、wca A、bap A等基因的轉(zhuǎn)錄水平與SbfR回補(bǔ)株的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:sRNA SbfR參與傷寒沙門菌熱應(yīng)激條件下生長、動力、侵襲、生物膜形成等方面的調(diào)節(jié),抑制熱應(yīng)激條件下細(xì)菌生長,促進(jìn)細(xì)菌動力、侵襲和生物膜形成能力。SbfR前69nt和后69nt回補(bǔ)株均可獨(dú)立完成全長SbfR對細(xì)菌動力的促進(jìn)作用,但在形成生物膜能力方面兩種部分回補(bǔ)株分別發(fā)揮全長SbfR的部分調(diào)控作用。
【圖文】：

傷寒沙門菌小 RNA SbfR 相關(guān)功能研究穩(wěn)態(tài)期表達(dá)量較高；酸應(yīng)激條件下，SbfR 表達(dá)上調(diào)，氧應(yīng)激條件下，，表達(dá)量下調(diào)[54,55]。但是 SbfR 在 S. Typhi 中發(fā)揮的作用有待進(jìn)行深入研究。

傷寒沙門菌小 RNA SbfR 相關(guān)功能研究3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 基因芯片3.1.1 SbfR 缺陷株與 SbfR 回補(bǔ)株雙色熒光疊加圖將兩張基因芯片的掃描結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，數(shù)據(jù)疊加后產(chǎn)生圖像，如圖3.1。在A 圖中，綠色表示該基因在缺陷株中轉(zhuǎn)錄水平比回補(bǔ)株低，紅色表示該基因在缺陷株中轉(zhuǎn)錄水平比回補(bǔ)株高。B 圖與 A 圖相反，綠色表示該基因在缺陷株中轉(zhuǎn)錄水平比回補(bǔ)株高，紅色表示該基因在缺陷株中轉(zhuǎn)錄水平比回補(bǔ)株低。黃色點(diǎn)為綠色熒光和紅色熒光的中和效果，表明該基因在SbfR 缺陷株和回補(bǔ)株中的表達(dá)豐度相似。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R378.22

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王哲鑫;吉瀅;趙昕;徐順高;黃新祥;;非編碼小RNA T64對傷寒沙門菌基因表達(dá)的影響[J];江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2014年04期

2 郭志燕;周明旭;段強(qiáng)德;朱國強(qiáng);;細(xì)菌鞭毛的致病性及其免疫學(xué)應(yīng)用的研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)報(bào);2014年03期

本文編號：2604322