【摘要】：萊茵衣藻是一種具有兩條等長纖毛的單細胞真核藻類,具有細胞周期短、實驗操作簡單等優(yōu)點,是一種比較典型的模式生物。纖毛是由細胞微管構(gòu)成的,處于細胞表面的保守器官。纖毛內(nèi)蛋白的組裝、維持和解聚主要依賴于“鞭毛內(nèi)運輸”(intraflagellar transport,簡稱IFT)機制,將蛋白復(fù)合體從纖毛基部到頂端的一種雙向運輸過程。纖毛內(nèi)結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生異常,會引起肥胖、糖尿病、內(nèi)臟轉(zhuǎn)移、多囊腎病、色素性視網(wǎng)膜炎、復(fù)性呼吸道感染、不育癥、智力遲鈍、多趾等癥狀。因此,研究IFT機制中蛋白顆粒復(fù)合物的相關(guān)作用,對纖毛病的發(fā)病機理和預(yù)防顯得尤為重要。IFT57位于IFT-B1和IFT-B2之間,參與纖毛內(nèi)的正向運輸,其對纖毛的組裝和維持是必須的。IFT57是與運動有關(guān)的蛋白,它的缺失導(dǎo)致纖毛軸絲蛋白的損傷,會影響信號傳導(dǎo),導(dǎo)致細胞運動能力喪失。但是人們對于其具體調(diào)節(jié)機制及其他功能還有待了解。因此,制備萊茵衣藻IFT57抗體,為進一步研究其維持纖毛長度和功能提供了前提。本研究通過對ift57基因的CDS序列進行生物信息學(xué)分析,選取其N端319～469 aa親水性序列,經(jīng)過PCR體外擴增獲取目的片段。分別構(gòu)建了帶有6×His和MBP標簽的原核表達載體pET-28a(+)-ift57和pMAL-c2X-ift57,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)0.2mMIPTG誘導(dǎo)表達蛋白,以12%SDS-PAGE鑒定,分別獲得分子量大小為18 KDa和57.2 KDa的重組蛋白片段。對兩種融合蛋白進行親和層析純化,將6×His-IFT57目的蛋白作為抗原,用其免疫新西蘭大白兔,采集第5次免疫后血液并分離血清。用MBP-IFT57目的蛋白作為固相結(jié)合物,利用間接ELISA法測定抗血清的效價,結(jié)果顯示大于256000。將抗血清經(jīng)Protein A純化后,Westem blotting檢測顯示所制備的IFT57多克隆抗體,能夠特異性識別衣藻中的IFT57蛋白。這一結(jié)果為表達純化溶解性較差的蛋白,及其抗體制備提供了借鑒意義。同時,所獲抗體為深入研究IFT57在鞭毛組裝中的作用機理奠定了堅實基礎(chǔ)。
【圖文】：

連接橋相連。這些與運動相關(guān)的蛋白結(jié)構(gòu)用于調(diào)控纖毛的運動。相反，不動纖毛缺逡逑少兩個中央微管，（“９＋０”型），，不包含與運動相關(guān)的蛋白，不能運動【２？６］。此外，逡逑埋藏在細胞內(nèi)的纖毛基體沒有中央微管，僅由９個三聯(lián)體的細胞微管構(gòu)成（圖１－１）。逡逑研究發(fā)現(xiàn)在纖毛的頂端還有一個類似帽子的結(jié)構(gòu)，通過絲狀結(jié)構(gòu)與頂端的纖毛逡逑膜和底部的中央微管相連，我們稱之為“鞭毛帽子復(fù)合體”邋［２＇目前對該結(jié)構(gòu)的認逡逑識還不清楚。此外，在纖毛的基體上面存在調(diào)控蛋白進出纖毛的結(jié)構(gòu)－過渡纖維逡逑（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｆｉｂｅｒ）。從基體頂端到中央微管的區(qū)域，區(qū)域的中央有１個桶狀和一個管逡逑狀結(jié)構(gòu)上下排列，即上文所述的過渡區(qū)［２８】。逡逑２逡逑

驅(qū)動蛋白－２邋（ｋｉｎｅｓｉｎ－２）提供動力，由纖毛基部到頂端發(fā)生運動［４２］；逆［＾輸是依逡逑靠亞蛋白復(fù)合物ＩＦＴ－Ａ，利用細胞質(zhì)動力蛋白（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ邋ｄｙｎｅｉｎＤｈｃｌｂ）提供動力，逡逑由纖毛頂端到基部的運動［５３，５４】（圖１－３）。其中，纖毛亞基蛋白ＥＦＴ復(fù)合體Ａ和復(fù)合逡逑體Ｂ的突變，會引起纖毛運動性的喪失或纖毛的缺陷，從而導(dǎo)致人類出現(xiàn)肥胖、糖逡逑尿病、內(nèi)臟轉(zhuǎn)移、多囊腎病、色素性視網(wǎng)膜炎、復(fù)性呼吸道感染、不育癥、智力遲逡逑鈍、多趾等癥狀［５５】。馬達蛋白的缺陷，會導(dǎo)致新的纖毛無法生成或者己經(jīng)ｋ成的纖逡逑毛發(fā)生縮短解聚。另外，ＩＦＴ轉(zhuǎn)運蛋白也參與了纖毛信號傳導(dǎo)過程，許多＃號傳遞逡逑通路（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ，Ｗｎｔ，邋ＰＤＧＦＲａａ）是轉(zhuǎn)運蛋白進出纖毛所必須的［２９】。因�。欤椋簦芯垮义希桑疲詸C制中兩種馬達蛋白的轉(zhuǎn)換、ＩＦＴ蛋白顆粒復(fù)合物的進出機制等相關(guān)作用，對纖逡逑毛病的發(fā)病機理和預(yù)防顯得尤為重要。逡逑５逡逑
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

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本文編號：2604071