發(fā)布時(shí)間：2020-03-28 06:29

【摘要】：萊茵衣藻是一種具有兩條等長(zhǎng)纖毛的單細(xì)胞真核藻類(lèi),具有細(xì)胞周期短、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),是一種比較典型的模式生物。纖毛是由細(xì)胞微管構(gòu)成的,處于細(xì)胞表面的保守器官。纖毛內(nèi)蛋白的組裝、維持和解聚主要依賴(lài)于“鞭毛內(nèi)運(yùn)輸”(intraflagellar transport,簡(jiǎn)稱(chēng)IFT)機(jī)制,將蛋白復(fù)合體從纖毛基部到頂端的一種雙向運(yùn)輸過(guò)程。纖毛內(nèi)結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生異常,會(huì)引起肥胖、糖尿病、內(nèi)臟轉(zhuǎn)移、多囊腎病、色素性視網(wǎng)膜炎、復(fù)性呼吸道感染、不育癥、智力遲鈍、多趾等癥狀。因此,研究IFT機(jī)制中蛋白顆粒復(fù)合物的相關(guān)作用,對(duì)纖毛病的發(fā)病機(jī)理和預(yù)防顯得尤為重要。IFT57位于IFT-B1和IFT-B2之間,參與纖毛內(nèi)的正向運(yùn)輸,其對(duì)纖毛的組裝和維持是必須的。IFT57是與運(yùn)動(dòng)有關(guān)的蛋白,它的缺失導(dǎo)致纖毛軸絲蛋白的損傷,會(huì)影響信號(hào)傳導(dǎo),導(dǎo)致細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力喪失。但是人們對(duì)于其具體調(diào)節(jié)機(jī)制及其他功能還有待了解。因此,制備萊茵衣藻IFT57抗體,為進(jìn)一步研究其維持纖毛長(zhǎng)度和功能提供了前提。本研究通過(guò)對(duì)ift57基因的CDS序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,選取其N(xiāo)端319～469 aa親水性序列,經(jīng)過(guò)PCR體外擴(kuò)增獲取目的片段。分別構(gòu)建了帶有6×His和MBP標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pET-28a(+)-ift57和pMAL-c2X-ift57,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)0.2mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白,以12%SDS-PAGE鑒定,分別獲得分子量大小為18 KDa和57.2 KDa的重組蛋白片段。對(duì)兩種融合蛋白進(jìn)行親和層析純化,將6×His-IFT57目的蛋白作為抗原,用其免疫新西蘭大白兔,采集第5次免疫后血液并分離血清。用MBP-IFT57目的蛋白作為固相結(jié)合物,利用間接ELISA法測(cè)定抗血清的效價(jià),結(jié)果顯示大于256000。將抗血清經(jīng)Protein A純化后,Westem blotting檢測(cè)顯示所制備的IFT57多克隆抗體,能夠特異性識(shí)別衣藻中的IFT57蛋白。這一結(jié)果為表達(dá)純化溶解性較差的蛋白,及其抗體制備提供了借鑒意義。同時(shí),所獲抗體為深入研究IFT57在鞭毛組裝中的作用機(jī)理奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
【圖文】：

連接橋相連。這些與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的蛋白結(jié)構(gòu)用于調(diào)控纖毛的運(yùn)動(dòng)。相反，不動(dòng)纖毛缺逡逑少兩個(gè)中央微管，（“９＋０”型），，不包含與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的蛋白，不能運(yùn)動(dòng)【２？６］。此外，逡逑埋藏在細(xì)胞內(nèi)的纖毛基體沒(méi)有中央微管，僅由９個(gè)三聯(lián)體的細(xì)胞微管構(gòu)成（圖１－１）。逡逑研究發(fā)現(xiàn)在纖毛的頂端還有一個(gè)類(lèi)似帽子的結(jié)構(gòu)，通過(guò)絲狀結(jié)構(gòu)與頂端的纖毛逡逑膜和底部的中央微管相連，我們稱(chēng)之為“鞭毛帽子復(fù)合體”邋［２＇目前對(duì)該結(jié)構(gòu)的認(rèn)逡逑識(shí)還不清楚。此外，在纖毛的基體上面存在調(diào)控蛋白進(jìn)出纖毛的結(jié)構(gòu)－過(guò)渡纖維逡逑（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｆｉｂｅｒ）。從基體頂端到中央微管的區(qū)域，區(qū)域的中央有１個(gè)桶狀和一個(gè)管逡逑狀結(jié)構(gòu)上下排列，即上文所述的過(guò)渡區(qū)［２８】。逡逑２逡逑

驅(qū)動(dòng)蛋白－２邋（ｋｉｎｅｓｉｎ－２）提供動(dòng)力，由纖毛基部到頂端發(fā)生運(yùn)動(dòng)［４２］；逆［＾輸是依逡逑靠亞蛋白復(fù)合物ＩＦＴ－Ａ，利用細(xì)胞質(zhì)動(dòng)力蛋白（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ邋ｄｙｎｅｉｎＤｈｃｌｂ）提供動(dòng)力，逡逑由纖毛頂端到基部的運(yùn)動(dòng)［５３，５４】（圖１－３）。其中，纖毛亞基蛋白ＥＦＴ復(fù)合體Ａ和復(fù)合逡逑體Ｂ的突變，會(huì)引起纖毛運(yùn)動(dòng)性的喪失或纖毛的缺陷，從而導(dǎo)致人類(lèi)出現(xiàn)肥胖、糖逡逑尿病、內(nèi)臟轉(zhuǎn)移、多囊腎病、色素性視網(wǎng)膜炎、復(fù)性呼吸道感染、不育癥、智力遲逡逑鈍、多趾等癥狀［５５】。馬達(dá)蛋白的缺陷，會(huì)導(dǎo)致新的纖毛無(wú)法生成或者己經(jīng)ｋ成的纖逡逑毛發(fā)生縮短解聚。另外，ＩＦＴ轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也參與了纖毛信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，許多＃號(hào)傳遞逡逑通路（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ，Ｗｎｔ，邋ＰＤＧＦＲａａ）是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)出纖毛所必須的［２９】。因�。欤椋簦芯垮义希桑疲詸C(jī)制中兩種馬達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)換、ＩＦＴ蛋白顆粒復(fù)合物的進(jìn)出機(jī)制等相關(guān)作用，對(duì)纖逡逑毛病的發(fā)病機(jī)理和預(yù)防顯得尤為重要。逡逑５逡逑
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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