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MiR-101a表觀調(diào)控Cox-2基因表達(dá)及軟骨發(fā)育的相關(guān)性研究

發(fā)布時(shí)間：2020-03-28 04:41

【摘要】：MicroRNAs是內(nèi)源性的干擾體內(nèi)蛋白生成的非編碼RNAs,可抑制m RNA翻譯為蛋白質(zhì)的過(guò)程同時(shí)也可以調(diào)節(jié)m RNA的穩(wěn)定性,從而成為了調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵因素。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),micro RNAs中的一個(gè)關(guān)鍵的成員mi R-101在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的正常生理(如血管的生成,受精卵的著床)以及病理狀態(tài)下(如實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展和關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程中)均起到非常關(guān)鍵的作用。本綜述將著重討論micro RNA如何通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子,信號(hào)通路蛋白,表觀遺傳調(diào)控過(guò)程的關(guān)鍵蛋白因子以及體內(nèi)的一些關(guān)鍵酶類來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。通過(guò)以上的綜述將幫助我們系統(tǒng)地了解mi R-101在體內(nèi)生理病理狀態(tài)下發(fā)揮作用的方式,從而為今后mi R-101可能的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。研究背景:軟骨內(nèi)骨形成被認(rèn)為是人體內(nèi)長(zhǎng)骨或四肢骨發(fā)生的重要形式,在這一過(guò)程中靜息的軟骨細(xì)胞不斷增殖,同時(shí)伴隨著II型膠原和蛋白聚糖的積累,最后軟骨細(xì)胞在相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控下轉(zhuǎn)變?yōu)榉蚀筌浌羌?xì)胞并同時(shí)積累X型膠原蛋白。軟骨細(xì)胞的肥大伴隨而來(lái)的是肥大時(shí)期相關(guān)的基因如Col10a1、Cox-2和Mmp-13等表達(dá)量增高。環(huán)氧化酶2(Cox-2)是已知的機(jī)體受到相應(yīng)刺激后快速產(chǎn)生的一種誘導(dǎo)酶,具有廣泛生理作用。本實(shí)驗(yàn)室此前的研究表明,Cox-2表達(dá)增高促進(jìn)軟骨細(xì)胞向肥大方向分化,這主要是通過(guò)調(diào)控肥大軟骨的相關(guān)標(biāo)記基因如Col10a1實(shí)現(xiàn)的。研究目的:(1)探究mi R-101a mimic和inhibitor干預(yù)后對(duì)肥大期MCT和ATDC5軟骨細(xì)胞肥大相關(guān)基因Col10a1、Cox-2以及Mmp-13的作用,同時(shí)探索mi R-101a mimic和inhibitor干預(yù)后對(duì)于軟骨細(xì)胞肥大化進(jìn)程的影響。(2)探索mi R-101a mimic和inhibitor干預(yù)后在增殖期MCT和ATDC5中對(duì)軟骨細(xì)胞增殖情況的影響。(3)探究mi R-101a調(diào)控軟骨細(xì)胞發(fā)育過(guò)程的潛在機(jī)制。研究方法:(1)運(yùn)用Targetscan,Mi Randa網(wǎng)站在線預(yù)測(cè)Cox-2和Col10a1的3’UTR區(qū)域是否存在mi R-101a的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析,確認(rèn)mi R-101a與Col10a1、Cox-2的3’UTR區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)。(2)隨著培養(yǎng)條件的改變,兩株軟骨細(xì)胞模型由增殖期向肥大期的轉(zhuǎn)化。應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù),在小鼠MCT和ATDC5兩株細(xì)胞系檢測(cè)兩個(gè)時(shí)期Col10a1、Cox-2和mi R-101a的表達(dá)情況。(3)通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MCT細(xì)胞和慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ATDC5細(xì)胞得到mi R-101a mimic和inhibitor干預(yù)細(xì)胞模型;并應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)、免疫印跡技術(shù)(WB)、Ed U細(xì)胞增殖成像技術(shù)和細(xì)胞染色技術(shù)來(lái)探討mi R-101a mimic和inhibitor干預(yù)后對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和肥大化進(jìn)程的影響。(4)應(yīng)用Pathway Builder Tool2.0(www.proteinlounge.com)軟件繪制簡(jiǎn)單的基因相互作用結(jié)構(gòu)圖譜來(lái)闡釋mi R-101a與一些肥大軟骨時(shí)期相關(guān)基因的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。研究結(jié)果:(1)生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果顯示mi R-101a與Cox-2、Col10a1的3’UTR區(qū)域存在結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步地,相應(yīng)報(bào)告基因的分析結(jié)果顯示mi R-101a與Cox-2的3’UTR區(qū)域存在結(jié)合,然而與Col10a1的3’UTR區(qū)域不存在明顯結(jié)合。(2)熒光定量PCR的結(jié)果顯示:與增殖期的MCT和ATDC5細(xì)胞相比,軟骨細(xì)胞肥大時(shí)期相關(guān)基因Col10a1、Cox-2呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),而mi R-101a基因表達(dá)降低。(3)在MCT和ATDC5細(xì)胞中mi R-101a mimic干預(yù)后,結(jié)果顯示mi R-101a抑制軟骨肥大相關(guān)基因的表達(dá);在MCT和ATDC5細(xì)胞中mi R-101a inhibitor干預(yù)后,結(jié)果顯示軟骨肥大相關(guān)基因表達(dá)增高。在兩株軟骨細(xì)胞中mi R-101a mimic和inhibitor干預(yù)后對(duì)Sox9和Runx2基因表達(dá)沒(méi)有產(chǎn)生明顯影響。(4)Ed U細(xì)胞增殖成像和阿爾新藍(lán)染色結(jié)果顯示mi R-101a mimic干預(yù)后可抑制軟骨細(xì)胞的增殖,mi R-101a inhibitor干預(yù)后可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。研究結(jié)論:生物信息學(xué)預(yù)測(cè)Cox-2與Col10a1基因3’UTR存在mi R-101結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)一步地?zé)晒馑孛笀?bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明mi R-101a只與Cox-2的3’UTR區(qū)域存在結(jié)合作用。Mi R-101a可能通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因Cox-2,調(diào)控基因表達(dá)并在軟骨發(fā)育時(shí)期發(fā)揮了重要作用。
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