【摘要】：目的:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是一類具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞,在不同誘導(dǎo)條件下能分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等多種組織細(xì)胞,是組織工程中理想的種子細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨及成脂分化受到Wnt信號通路等多種因素的調(diào)控。NDRG1被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子,受到癌基因N-myc的調(diào)節(jié)。目前關(guān)于NDRG1調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的作用尚無文獻(xiàn)報道,本研究探討NDRG1對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨及成脂分化的作用,并初步闡釋其作用機(jī)制。方法:一、NDRG1對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂及成骨分化的作用1.檢測Ndrg1 mRNA的組織分布。運(yùn)用qRT-PCR的方法檢測在6周齡C57BL/6J小鼠不同組織中Ndrg1 mRNA的表達(dá)量,包括心、脾、肺、胃、腦、腎、結(jié)腸、小腸、骨、骨骼肌、胃腸脂肪、附睪脂肪、腎周脂肪和腹股溝脂肪組織。2.運(yùn)用qRT-PCR的方法檢測在小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST2成脂及成骨誘導(dǎo)分化過程中的Ndrg1 mRNA表達(dá)量的變化。3.構(gòu)建Ndrg1過表達(dá)載體。在ST2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Ndrg1過表達(dá)載體及對照載體pcDNA3.1,進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化,通過油紅O染色觀察ST2成脂分化的情況,qRT-PCR檢測成脂分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、CCATT增強(qiáng)結(jié)合蛋白α(CCAAT enhancer binding proteinα,C/EBPα)和標(biāo)志基因脂肪細(xì)胞蛋白2(Adipocyte Protein 2,aP2)、adipsin的mRNA表達(dá)量,Western blotting檢測PPARγ、C/EBPα和aP2的蛋白表達(dá)量;轉(zhuǎn)染后誘導(dǎo)成骨分化,運(yùn)用堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色觀察ST2細(xì)胞的成骨分化狀態(tài),qRT-PCR檢測成骨分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、Osterix和標(biāo)志基因Alp、骨橋素(Osteopontin,Opn)的mRNA表達(dá)量,Western blotting檢測Runx2、Osterix、ALP和OPN的蛋白表達(dá)量。4.設(shè)計合成Ndrg1的siRNA,將Ndrg1 siRNA及對照siRNA轉(zhuǎn)染于ST2細(xì)胞中,抑制ST2細(xì)胞中Ndrg1的內(nèi)源性表達(dá)并進(jìn)行成脂及成骨誘導(dǎo)分化,運(yùn)用油紅O染色及ALP染色觀察ST2細(xì)胞分化狀態(tài),運(yùn)用qRT-PCR和Western blotting的方法檢測抑制Ndrg1的內(nèi)源性表達(dá)后對ST2細(xì)胞成脂及成骨分化的作用。5.構(gòu)建Ndrg1敲低慢病毒,用Ndrg1敲低慢病毒及pLVX-shRNA2對照慢病毒感染小鼠BMSCs,進(jìn)行成脂及成骨誘導(dǎo)分化,運(yùn)用油紅O染色、ALP染色和qRT-PCR方法檢測Ndrg1敲低慢病毒對小鼠BMSCs成脂及成骨分化的作用。二、NDRG1對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂及成骨分化作用的機(jī)制研究1.在ST2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Ndrg1過表達(dá)載體,在未誘導(dǎo)情況下收取ST2細(xì)胞總蛋白,運(yùn)用Western blotting的方法檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白,β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(Low density lipoprotein receptor related protein 6,LRP6)的蛋白量;轉(zhuǎn)染后運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光染色的方法檢測β-catenin蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)情況;轉(zhuǎn)染后收取ST2細(xì)胞的核蛋白,檢測β-catenin及轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2(Transcription factor 7-like 2,TCF7L2)在細(xì)胞核中的蛋白量。2.利用Ndrg1 siRNA抑制ST2細(xì)胞中Ndrg1的內(nèi)源性表達(dá),在未誘導(dǎo)情況下運(yùn)用Western blotting檢測β-catenin、LRP6和TCF7L2的蛋白量,細(xì)胞免疫熒光染色檢測β-catenin蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)情況。結(jié)果:一、NDRG1對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂及成骨分化的作用1.Ndrg1在6周齡C57BL/6J小鼠的各個組織中均有表達(dá),其中Ndrg1 mRNA在小腸中的表達(dá)水平最低,在脂肪組織中的表達(dá)水平中等,而在腎及骨組織中表達(dá)水平最高。2.在小鼠BMSCs的成脂或成骨誘導(dǎo)分化過程中Ndrg1的mRNA表達(dá)水平均呈先下調(diào)而后上調(diào)的趨勢。另外,在小鼠ST2細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)分化過程中,Ndrg1的mRNA表達(dá)水平呈先下調(diào)而后上調(diào)的趨勢,而在成骨誘導(dǎo)分化過程中Ndrg1的mRNA表達(dá)水平持續(xù)上調(diào)。3.利用構(gòu)建的Ndrg1過表達(dá)載體使ST2細(xì)胞內(nèi)的Ndrg1表達(dá)上調(diào),成脂誘導(dǎo)分化后,與對照組相比,過表達(dá)Ndrg1后ST2細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化增加,PPARγ、C/EBPα、aP2和adipsin的mRNA表達(dá)水平上調(diào),PPARγ、C/EBPα和aP2的蛋白水平上調(diào);成骨誘導(dǎo)分化后,與對照組相比,ST2細(xì)胞的成骨分化能力減弱,Runx2、Osterix、Alp和Opn的mRNA及蛋白水平均下調(diào)。4.利用Ndrg1的siRNA抑制ST2細(xì)胞中Ndrg1的內(nèi)源性表達(dá),成脂誘導(dǎo)分化后,與對照組相比,抑制Ndrg1的內(nèi)源性表達(dá)后ST2細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化減少,PPARγ、C/EBPα、aP2和adipsin的mRNA表達(dá)水平下調(diào),PPARγ、C/EBPα和aP2的蛋白水平下調(diào);成骨誘導(dǎo)分化后,與對照組相比,ST2細(xì)胞的成骨分化能力增強(qiáng),Runx2、Osterix、Alp和Opn的mRNA及蛋白水平均上調(diào)。5.利用Ndrg1的敲低慢病毒抑制小鼠BMSCs中Ndrg1的內(nèi)源性表達(dá),進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化,與對照組相比,感染Ndrg1敲減慢病毒后BMSCs的成脂分化減少,PPARγ、C/EBPα、aP2和adipsin的mRNA表達(dá)水平下調(diào);成骨誘導(dǎo)分化后,BMSCs的成骨分化能力增強(qiáng),Runx2、Osterix和成骨標(biāo)志基因I型膠原(collagen type I alpha 1,Col1a1)的mRNA表達(dá)水平上調(diào)。二、NDRG1對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂及成骨分化作用的機(jī)制研究1.利用構(gòu)建的Ndrg1過表達(dá)載體使ST2細(xì)胞內(nèi)Ndrg1的表達(dá)上調(diào),Western blotting結(jié)果顯示在未誘導(dǎo)情況下,細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin,磷酸化LPR6(p-LRP6)的蛋白量減少;細(xì)胞免疫熒光實驗表明β-catenin蛋白由細(xì)胞漿向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移減少;Western blotting結(jié)果顯示ST2細(xì)胞核中β-catenin的蛋白量減少,轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2的蛋白量也減少。2.利用Ndrg1的siRNA抑制ST2細(xì)胞中Ndrg1的內(nèi)源性表達(dá),Western blotting結(jié)果顯示在未誘導(dǎo)情況下,β-catenin和p-LRP6的蛋白量增加;細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果表明β-catenin蛋白由細(xì)胞漿向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移增加;Western blotting結(jié)果顯示細(xì)胞核中β-catenin的蛋白量增加,轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2的蛋白量也增加。結(jié)論:1.NDRG1促進(jìn)小鼠BMSCs和ST2細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化,而抑制其向成骨細(xì)胞分化。2.NDRG1通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂及成骨分化。
【圖文】：

圖1.1 pcDNA3.1載體結(jié)構(gòu)圖與酶切的 pcDNA3.1 質(zhì)粒進(jìn)行連接，μl 的連接體系：中孵育 1 h 后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。物加到50 μl的DH5α感受態(tài)中，，用槍頭，立即轉(zhuǎn)移至冰上，冰浴 2 min；體積（或質(zhì)物3 μl1 μl1 μl2 μl補(bǔ)充至10 μl

圖 1.2 pLVX-shRNA2 載體結(jié)構(gòu)圖連接目的片段和酶切的 pLVX-shRNA2 質(zhì)粒體積2 μl2 μl2 μl4 μl孵育 3 h，進(jìn)行轉(zhuǎn)化；體方法同前； 鑒定：挑取單菌落進(jìn)行菌液 PCR，其中菌LVX-shRNA2 的通用引物 2324F，2324F 的TAGGTTTGCAG-3′。具體實驗方法同前；：用MluⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切構(gòu)建的Ndrg1敲低凝膠電泳，鑒定正確后送測序，具體實驗：測序正確后，將Ndrg1敲低慢病毒載體轉(zhuǎn)
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 孟凡榮;陳琛;萬海粟;周清華;;慢病毒載體及其研究進(jìn)展[J];中國肺癌雜志;2014年12期

2 李雙月;戚媛;陳若琳;王哲敏;劉爽;樸豐源;;全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及優(yōu)勢[J];中國組織工程研究;2014年10期

3 陳思凡;孫健;鄭琳;張子麗;孫延雙;馮翔;;小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中過氧化物酶增殖物激活受體γ與CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α的表達(dá)[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2010年41期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 杲麗;NDRG2調(diào)節(jié)骨髓間充干細(xì)胞成骨成脂分化機(jī)制的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

本文編號：2600699