發(fā)布時(shí)間：2020-03-26 08:16

【摘要】：肝癌(Hepatic carcinoma)是發(fā)病率較高的一類癌癥,調(diào)查表明肝癌目前在我國的死亡率僅次于肺癌與胃癌,嚴(yán)重威脅人類的健康。由于肝癌的誘發(fā)因素比較多,并且肝癌發(fā)展速度較快,預(yù)后較差,術(shù)后容易復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,所以肝癌發(fā)病機(jī)制和治療的研究是目前醫(yī)學(xué)研究中較為嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展,靶向基因—病毒聯(lián)合治療已成為肝癌治療研究的新導(dǎo)向。本課題以靶向基因—病毒聯(lián)合治療為背景,構(gòu)建攜帶海洋凝集素基因的重組溶瘤痘苗病毒,研究其對肝癌MHCC97-H細(xì)胞裸鼠皮下移植模型的治療作用。我們選用海洋生物鱟的凝集素(Tachypleus tridentatus lectin,TTL),它是一種脂多糖結(jié)合凝集素,能夠阻斷動(dòng)物機(jī)體內(nèi)由脂多糖產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。選用的載體是溶瘤痘苗病毒,溶瘤痘苗病毒具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞特異性裂解的能力,并通過血管關(guān)閉間接影響腫瘤生長。溶瘤痘苗病毒在全身施用后具有與淋巴細(xì)胞結(jié)合的天然能力,但為了逃避抗體和免疫系統(tǒng)的其他組分,治療劑量必須非常高。我們結(jié)合外源基因與痘苗病毒載體各自的優(yōu)勢,以溶瘤痘苗病毒為載體構(gòu)建重組溶瘤痘苗病毒oncoVV-TTL,研究其對肝癌細(xì)胞的殺傷作用。我們通過TCID_(50)實(shí)驗(yàn)分析TTL基因?qū)θ芰龆幻绮《緩?fù)制能力的影響,結(jié)果顯示oncoVV-TTL與對照病毒oncoVV分別感染肝癌細(xì)36h之后,oncoVV-TTL的復(fù)制能力顯著高于oncoVV。接著我們采用肝癌細(xì)胞MHCC97-H構(gòu)建裸鼠肝癌皮下移植模型,在荷瘤體積達(dá)到120mm~3時(shí)均勻的分成三組,分別設(shè)為PBS組、oncoVV組、oncoVV-TTL組。然后三組分別腹腔注射1X10~7 PFU/100μL的oncoVV-TTL和oncoVV,100μL的PBS,共注射兩次,第一次與第二次間隔15天。以oncoVV組和PBS組作為對照組通過荷瘤體積大小的測量和小動(dòng)物活體成像實(shí)驗(yàn)來探究oncoVV-TTL對荷瘤小鼠的作用效果。結(jié)果顯示oncoVV-TTL在作用小鼠荷瘤模型25天之后與oncoVV和PBS組相比對荷瘤體積的增長具有較顯著的抑制作用。我們進(jìn)一步通過Western blot與報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)探究oncoVV-TTL在肝癌細(xì)胞中的作用機(jī)制。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TTL促進(jìn)ERK(Extracellular regulated protein kinases)蛋白的磷酸化,并抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)抗病毒因子MAVS(Mitochondrial antiviral signaling protein),IFI16(Gamma interferon inducible protein 16),MDA5(Melanoma differentiation associated protein 5)的表達(dá)。報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示TTL抑制干擾素IFN-β(Interferon-β)的轉(zhuǎn)錄活性。綜上所述,我們認(rèn)為TTL基因促進(jìn)ERK的激活,抑制抗病毒蛋白MDA5、MAVS、IFI16、和干擾素IFN-β的表達(dá),從而增強(qiáng)了病毒的復(fù)制能力,促進(jìn)了oncoVV-TTL對腫瘤的抑制作用。我們進(jìn)一步通過使用ERK的抑制劑U0126與病毒聯(lián)合作用肝癌細(xì)胞,來檢測病毒的復(fù)制是否與ERK相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示oncoVV不論是單獨(dú)作用還是與U0126聯(lián)合作用它的復(fù)制能力都沒有明顯變化,但oncoVV-TTL與U0126聯(lián)合作用時(shí)的復(fù)制能力且顯著低于oncoVV-TTL單獨(dú)作用時(shí)的復(fù)制能力。這一結(jié)果證實(shí)了TTL基因促進(jìn)ERK蛋白的磷酸化來增強(qiáng)病毒的復(fù)制。該研究為將oncoVV-TTL轉(zhuǎn)化成臨床的抗肝癌藥物提供了研究基礎(chǔ)。
【圖文】：

VV-TTL 包裝過程的鑒定結(jié)果-Flag-TTL-C1 的鑒定瑞基因有限公司合成連接在載體 pΜ pΜC57 為模板，Primer1，Primer2 切，同時(shí)對載體 pEGFP-C1 采用相同回收，按照連接體系進(jìn)行連接過夜，R 鑒定，結(jié)果如圖 4.1 所示：我們通 基因序列。因此證明目的基因成功

模型的生長3.1.2 重組質(zhì)粒 pCB-Flag-TTL 的鑒定為了獲得 pCB-Flag-TTL，我們以 pEGFP-Flag-TTL-C1 載體為模板，以 Prim3，Primer4 為引物，獲得目的基因 Flag-TTL，結(jié)果如下圖 A 所示，F(xiàn)lag-TTL載體 pEGFP-Flag-TTL-C1 獲得。然后使用 XbaI 和 BglII 兩種限制性內(nèi)切酶分對目的基因和載體 pCB 進(jìn)行酶切，載體酶切結(jié)果如圖 B 所示，pCB 載體被線化，其片段長度是 4800bp。分別對目的基因與載體進(jìn)行割膠回收，將回收的產(chǎn)連接過夜，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，搖菌后抽提質(zhì)粒再次進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定結(jié)如圖 C 所示，新構(gòu)建的 pCB-Flag-TTL 通過雙酶切可以成功的獲得 500bp 的片序列，該片段大小與目的基因大小相似。為了進(jìn)一步證明 Flag-TTL 序列是否功的連接在載體 pCB 上，，對載體與目的基因進(jìn)行測序驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果顯示沒任何突變位點(diǎn)，可以使用構(gòu)建好的 pCB-Flag-TTL 包裝新型溶瘤痘苗病毒。
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2601185