【摘要】：目的:耳鳴是當(dāng)前發(fā)病率較高、治療效果較差的常見病。在成年人的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),患有程度不同耳鳴的大約占6%-10%,其中還有一部分人因?yàn)槎Q問題甚至影響正常的工作及生活~([1]),成為臨床上迫切解決的難題之一。關(guān)于耳鳴的發(fā)病機(jī)制目前還不是很清楚,有許多假說,最主要的假說主要有兩種:一、認(rèn)為耳鳴與外周的聽覺系統(tǒng)有關(guān):二、認(rèn)為耳鳴的發(fā)生主要與聽覺中樞系統(tǒng)發(fā)生的可塑性有關(guān)。基于上述兩種假說,本文從聽覺通路上外周及中樞聽覺系統(tǒng)兩個(gè)點(diǎn)分別進(jìn)行研究,探討耳鳴還不為人知的發(fā)病機(jī)制,在今后耳鳴的研究,臨床治療上提供新的理論基礎(chǔ)。目前,關(guān)于耳鳴與外周聽覺系統(tǒng)的研究已有很多,對(duì)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸(ribbon synapse,RS)的研究目前較少,它是將聲音信息傳遞到聽覺神經(jīng)中樞的第一個(gè)傳入神經(jīng)突觸。眾所周知,突觸的傳遞效能不是固定不變的。突觸神經(jīng)元發(fā)生興奮時(shí),引起神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生釋放,這個(gè)過程會(huì)引起突觸后電位發(fā)生改變,來達(dá)到完成電信號(hào)發(fā)生傳遞的目標(biāo),在這個(gè)過程中,我們可以發(fā)現(xiàn)突觸在數(shù)量、功能和形態(tài)三方面均發(fā)生了改變。在這個(gè)變化過程中,突觸傳遞功能有可能發(fā)生增強(qiáng),也有可能出現(xiàn)減弱;在時(shí)間上可以是時(shí)間較短(數(shù)秒到數(shù)分鐘);也可以是時(shí)間較長(數(shù)小時(shí)到數(shù)周)。這些變化統(tǒng)稱為突觸可塑性。帶狀突觸發(fā)生的可塑性變化,包括數(shù)量、結(jié)構(gòu)及功能變化會(huì)影響聲音的編碼,目前關(guān)于這方面的研究還比較少�；谏鲜隹紤],本研究擬在水楊酸鈉誘導(dǎo)的耳鳴的大鼠模型中,應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)的方法,分別對(duì)RIBEYE蛋白(突觸前結(jié)構(gòu)蛋白)及GluR2-3蛋白(突觸后膜受體蛋白)進(jìn)行標(biāo)記,3Dmax8.0軟件三維重建后的數(shù)量分析;應(yīng)用透射電鏡觀察內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸的微觀結(jié)構(gòu)在耳鳴發(fā)生前后的變化察;Western blotting對(duì)otoferlin蛋白進(jìn)行半定量檢測(cè),通過檢測(cè)otoferlin蛋白的變化,間接反應(yīng)帶狀突觸功能方面的變化。綜上所述,本研究對(duì)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸數(shù)量、結(jié)構(gòu)及功能的可塑性進(jìn)行研究,可以對(duì)耳鳴發(fā)病機(jī)制的研究有一個(gè)新的補(bǔ)充。在研究耳鳴發(fā)病機(jī)制中,人們?cè)絹碓疥P(guān)注聽皮層神經(jīng)可塑性在耳鳴發(fā)病過程中的作用,比較公認(rèn)的觀點(diǎn)認(rèn)為:當(dāng)突觸傳入信號(hào)發(fā)生改變時(shí),會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)興奮性短時(shí)間或長時(shí)間發(fā)生繼發(fā)改變。這些改變包括很多方面:神經(jīng)元細(xì)胞膜發(fā)生變化(如離子通道出現(xiàn)開放或關(guān)閉)、突觸發(fā)生改變(如神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、攝取及結(jié)合)、神經(jīng)的敏感性和分布范圍出現(xiàn)變化。Moller等~([2])在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)動(dòng)物出現(xiàn)聽力下降及耳聾時(shí),突觸傳入信號(hào)發(fā)生改變,整個(gè)聽覺系統(tǒng)出現(xiàn)了一種超敏反應(yīng),這種超敏反應(yīng)會(huì)被時(shí)聽覺中樞誤認(rèn)為聲音,這種誤認(rèn)就是耳鳴的發(fā)生鳴。實(shí)現(xiàn)突觸可塑性的機(jī)制有很多,包括改變釋放到突觸的神經(jīng)遞質(zhì)的量以及細(xì)胞對(duì)這些神經(jīng)遞質(zhì)的應(yīng)答方式~([3])。通過改變突觸上神經(jīng)遞質(zhì)受體的數(shù)量也可以實(shí)現(xiàn)突觸可塑性的變化~([4])。研究發(fā)現(xiàn),興奮性和抑制性神經(jīng)突觸的突觸可塑性均依賴于突觸后鈣離子(Ca~(2+))的釋放~([4-5])。Ca~(2+)在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝方面十分重要,是第二信使。在調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的生長、分化、突觸可塑性和死亡等方面Ca~(2+)信號(hào)通路發(fā)揮著十分重要的作用。鈣調(diào)蛋白(Calmodulin,CaM)是主要的Ca~(2+)結(jié)合蛋白,調(diào)控許多神經(jīng)細(xì)胞的重要功能~([6])。而Ca~(2+)/CaM依賴的蛋白激酶II(CaMKII)在突觸可塑性發(fā)生改變的過程中是關(guān)鍵蛋白~([7-8]),負(fù)責(zé)聯(lián)系神經(jīng)元興奮轉(zhuǎn)錄。到目前為止,有關(guān)耳鳴狀態(tài)下聽皮層細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度以及CaM/CaMKII信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中蛋白激酶的變化情況,尚未見報(bào)道。因此,我們采用水楊酸鈉誘導(dǎo)建立耳鳴大鼠模型,檢測(cè)耳鳴大鼠聽皮層中可塑性變化相關(guān)蛋白(CaM和CaMKII)的表達(dá)情況,探討耳鳴發(fā)生的中樞聽皮層源性發(fā)病機(jī)制。研究方法:選用Wistar大鼠72只,無外耳和中耳疾病,由中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。2月齡,體重245±21.21g。使用ABR進(jìn)行聽力評(píng)估。將大鼠隨機(jī)分為3部分,每部份分為4組,每組6只,其中的三組采用水楊酸鈉腹腔注射,350mg/kg,分別注射3d(3d組)、7d(7d組)、10d(10d組),另一組為對(duì)照組:為等時(shí)間點(diǎn)等體積腹腔注射生理鹽水。麻醉后,手術(shù)分離出耳蝸基底膜,一部分應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)記的方法,即綠色熒光代表CtBP2;紅色熒光代表突觸后膜GluR2-3。紅色和綠色熒光的同時(shí)出現(xiàn)表現(xiàn)的顏色為橙黃色,它的意義代表存在一個(gè)帶狀突觸。在激光共聚焦顯微鏡下,掃描耳蝸基底膜,利用3Dmax8.0軟件三維重建,分析內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸數(shù)量的變化過程;一部分在透射電鏡下進(jìn)行觀察,分析帶狀突觸內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)方面在耳鳴發(fā)生前后出現(xiàn)的變化。帶狀突觸是一個(gè)不斷發(fā)生變化的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu),在水楊酸鈉作用下,觀察帶狀突觸微觀結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出的不同特點(diǎn);另一部分,Western blotting的方法檢測(cè)otoferlin蛋白的表達(dá)。Otoferlin蛋白在突觸神經(jīng)遞質(zhì)的胞吐過程中發(fā)揮作用。水楊酸鈉作用的不同時(shí)間點(diǎn),otoferlin蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生變化,這些變化能間接反應(yīng)突觸的功能情況。另一實(shí)驗(yàn)中,我們?cè)龠x用Wistar大鼠36只,由中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,隨機(jī)分成3組,每組12只:空白對(duì)照組、生理鹽水組和耳鳴模型組。耳鳴模型組通過腹腔注射水楊酸鈉,350mg/kg,飲水抑制法行為學(xué)驗(yàn)證造模成功。運(yùn)用Fura-2/AM熒光分光光度計(jì)方法測(cè)定各組大鼠聽皮層神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離Ca~(2+)濃度;Western Blot方法檢測(cè)CaM/CaMKII表達(dá)及活性情況。結(jié)果:1、實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)過8天條件反射訓(xùn)練,均建立穩(wěn)定條件反射。在條件反射消退期,耳鳴組小鼠條件反射消退時(shí)間最短,統(tǒng)計(jì)分析顯示,各組間的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),耳鳴模型制作成功。2、對(duì)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸數(shù)量方面的研究分析發(fā)現(xiàn),注射水楊酸鈉第7d時(shí),觀察到的帶狀突觸數(shù)量最多,與對(duì)照組相比(P0.05);注射水楊酸鈉第3d時(shí),帶狀突觸數(shù)量沒有出現(xiàn)明顯改變;注射第10d時(shí),帶狀突觸數(shù)量卻出現(xiàn)了一個(gè)明顯的下降(P0.05)。3、在透射電鏡下,耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞核下區(qū)域帶狀突觸結(jié)構(gòu)可以清晰看到,包括帶狀突觸、囊泡、突觸間隙,還有突觸后致密帶等這些典型結(jié)構(gòu);在動(dòng)態(tài)觀察注射水楊酸鈉的不同時(shí)間點(diǎn)上,內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸的超微結(jié)構(gòu)和形態(tài)也不斷發(fā)生著改變,各不相同。4、Western blotting法檢測(cè)在140.5KD的位置檢測(cè)到otoferlin的表達(dá)。各時(shí)間點(diǎn)otoferlin表達(dá)量不斷發(fā)生變化,注射前otoferlin蛋白的表達(dá)還不是很高,在注射第3d時(shí)表達(dá)量已經(jīng)開始出現(xiàn)了增加,在第7d時(shí),我們可以看到表達(dá)量是最多的,在第10d時(shí)表達(dá)量反而出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)。各時(shí)間點(diǎn)otoferlin蛋白表達(dá)在各組間存在的差異是顯著的(P0.05)。5建立了大鼠耳鳴行為學(xué)模型后,耳鳴模型組的Ca~(2+)濃度出現(xiàn)了顯著升高(P0.05);同時(shí),聽皮層神經(jīng)細(xì)胞CaM表達(dá)也出現(xiàn)增高(P0.05)、CaMKII活性出現(xiàn)增強(qiáng)(P0.05)。結(jié)論:1、本課題使用的內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸數(shù)量的研究方法,可以解決因?yàn)閹钔挥|不存在于同一平面,不能準(zhǔn)確計(jì)算突觸數(shù)量的難題。2、注射水楊酸鈉后,內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸的數(shù)量出現(xiàn)不斷變化,剛開始呈現(xiàn)一個(gè)逐漸升高的狀態(tài),隨之又出現(xiàn)了減少,增加或減少了與螺旋神經(jīng)元之間的聯(lián)系,對(duì)耳鳴起到一定代償?shù)淖饔谩?、內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸在注射水楊酸鈉前后,它的形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)也同時(shí)發(fā)生著動(dòng)態(tài)變化,不同時(shí)期有不同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),這種微觀結(jié)構(gòu)上的動(dòng)態(tài)變化可能影響突觸的功能。4、otoferlin蛋白表達(dá)在水楊酸鈉注射前后也發(fā)生著動(dòng)態(tài)變化,可能機(jī)制是:otoferlin表達(dá)增加,提高了突觸內(nèi)囊泡的融合及突觸遞質(zhì)的釋放。otoferlin蛋白表達(dá)后期出現(xiàn)下降,考慮可能的原因?yàn)橛绊懲挥|新陳代謝,原有的形態(tài)和功能不能維持,影響otoferlin的表達(dá)。5、耳鳴大鼠聽皮層神經(jīng)細(xì)胞Ca~(2+)濃度的增加及其下游CaM/CaMKII信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活參與水楊酸鈉誘導(dǎo)的耳鳴發(fā)生,聽覺中樞的聽皮層內(nèi),有神經(jīng)異常電活動(dòng)及神經(jīng)細(xì)胞突觸可塑性的出現(xiàn),聽覺中樞出現(xiàn)的這些變化可能在耳鳴的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。
【圖文】：

熒光重合后雙標(biāo)記后的色對(duì)呈現(xiàn)一種橙黃色的顯示。當(dāng)熒光色對(duì)第一次出現(xiàn)時(shí)，序列掃描就正式開始進(jìn)行，直到掃描到熒光色對(duì)不再出現(xiàn)時(shí)時(shí)，掃描到此結(jié)束。這時(shí)，我們收集在此過程中二維合成的圖像，以序號(hào)順序排列。具體方法如圖1圖1 內(nèi)毛細(xì)胞序列掃描示意圖注：圖中A為內(nèi)毛細(xì)胞形態(tài)，其中橫截面為序列掃描的各個(gè)層面；B為一個(gè)序列掃描層面（X-Y），其中球體表示帶狀突觸；C為三維顯示多個(gè)序列掃描層面。2.3.6 三維建模打開計(jì)算機(jī) 3D max 軟件，選中菜單項(xiàng)目，將上一步掃描得到的序列調(diào)入視面窗口，按照從上到下的順序，，逐一導(dǎo)入掃描序列。例：首先將第一幅二維合成圖像先導(dǎo)入，出現(xiàn)橙色熒光的位置我們用球體做一個(gè)標(biāo)記。熒光的形狀越大， 標(biāo)記的球體也相應(yīng)越大，上下兩幅圖像中，橙色熒光如果出現(xiàn)的位置相同，則為同一個(gè)突觸；則代表新突觸。依此類方法逐一進(jìn)行， 3D max 軟件可以自動(dòng)算出在每個(gè)圖像中的突觸總數(shù)量（見圖 2

3Dmax8.0軟件全部窗口示意圖
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R764.45;R-332

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本文編號(hào)：2597702