【摘要】：CD47屬于免疫球蛋白超家族成員之一,在多種腫瘤細胞表面高表達,CD47通過結(jié)合巨噬細胞表面的SIRPα并發(fā)出“別吃我”信號從而促使腫瘤細胞逃避巨噬細胞吞噬作用。同時,CD47在活化T淋巴細胞中高表達,其能與血小板反應(yīng)蛋白1(TEP 1)結(jié)合,抑制T淋巴細胞的增殖與活化,進而影響T淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。因此抗CD47單克隆抗體可以作為腫瘤免疫治療中的一種新療法。而納米抗體是一種源于駱駝可變區(qū)的單域抗體,它是目前分子量最小且具有完全抗原結(jié)合功能的單域抗體,因此其在藥物開發(fā)中具有巨大的潛力同時可以作為研究癥斷的高親和試劑。本實驗利用高通量測序技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用獲得抗CD47駱駝納米抗體并檢測抗體的親和力,探索蛋白組學技術(shù)和基因組學技術(shù)在發(fā)現(xiàn)和鑒定過程中的價值。本研究內(nèi)容主要包括以下三個方面:1駱駝免疫抗體庫的高通量測序分析以及納米抗體數(shù)據(jù)庫的建立首先誘導表達以及純化BL21-pET30a-CD47的原核重組蛋白CD47并免疫新疆雙峰駝六次,通過間接ELISA方法測定第五次和第六次免疫血清中抗CD47抗體的滴度,分離全血中外周淋巴細胞,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過巢式PCR擴增駱駝VHH基因,并將擴增的VHH基因進行高通量測序,使用AbMining ToolBox分析高通量測序數(shù)據(jù),利用Python去除數(shù)據(jù)庫中的終止密碼子并建立抗CD47納米抗體氨基酸數(shù)據(jù)庫。間接ELISA測定第六次免疫血清抗CD47抗體滴度為1:384 000,說明抗原CD47在駱駝體內(nèi)激起了免疫反應(yīng),以cDNA為模板通過巢式PCR成功擴增VHH基因,利用高通量測序平臺Illumina HiSeq共獲得1 054 550條原始基因序列,去除接頭序列和低質(zhì)量序列后共獲得序列945 061條,其中有效讀長的核苷酸序列主要分布在300-350 nt,堿基質(zhì)量大于20占總序列的97.67%,堿基質(zhì)量大于30占總序列的95.58%。獲得抗CD47納米抗體氨基酸數(shù)據(jù)庫為9.19×10~5。經(jīng)AbMining ToolBox分析高通量測序數(shù)據(jù),得到160 485條特異性的CDR3序列,其氨基酸長度主要分布8-35,分析CDR3肽段等電點的主要分布,其中pI 8-9和4-5分別占22.72%和20.1%。2駱駝免疫血清中抗CD47特異性抗體的制備和鑒定首先利用ProteinA對駱駝血清中IgG進行親和純化,并通過間接ELISA和Western Blot測定IgG與原核重組蛋白CD47的結(jié)合活性,之后將CD47蛋白與CNBr瓊脂糖樹脂偶聯(lián)來捕獲抗CD47特異性抗體,并測定CD47-CNBr偶聯(lián)效率,最后通過ELISA和Western Blot檢測抗CD47特異性抗體與原核CD47抗原的結(jié)合活性,除此之外分別驗證血清,IgG和抗CD47特異性抗體與真核CD47和EC9706細胞的結(jié)合活性,從而為后續(xù)質(zhì)譜鑒定獲得一株能用于治療的抗體提供實驗基礎(chǔ)。實驗結(jié)果顯示,利用ProteinA從血清中純化的IgG經(jīng)間接ELISA和Western Blot測定表明,當IgG稀釋1:256 000仍然與原核表達的CD47蛋白仍具有良好的結(jié)合活性。經(jīng)15%SDS-PAGE顯示CD47蛋白成功偶聯(lián)于CNBr瓊脂糖樹脂并測定偶聯(lián)效率為67.8%,間接ELISA篩選純化抗CD47特異性抗體的洗脫液為pH 2.4的Gly-HCl,利用該洗脫液成功從CD47-CNBr瓊脂糖樹脂免疫親和純化出抗CD47特異性抗體。經(jīng)間接ELISA和Western Blot驗證抗CD47特異性抗體與原核CD47具有高結(jié)合活性和特異性。通過ELISA驗證血清,IgG和抗CD47特異性抗體與真核CD47的結(jié)合情況顯示,血清、Ig G與真核CD47蛋白和EC9706細胞有結(jié)合活性,相反,抗CD47特異性抗體與真核CD47和細胞無結(jié)合。3重鏈抗體的質(zhì)譜分析以及抗CD47納米抗體制備和鑒定首先對ProteinA免疫親和層析分離的IgG經(jīng)15%SDS-PAGE分離并切下其亞型重鏈抗體IgG2和IgG3再進行LC MS/MS鑒定,利用Mascot檢索軟件將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與駱駝納米抗體氨基酸數(shù)據(jù)庫匹配,并將匹配得分最高的3條序列克隆表達,利用間接ELISA測序其與原核CD47蛋白結(jié)合,從中挑選結(jié)合活性最高的抗CD47納米抗體并驗證該納米抗體與真核CD47的結(jié)合,同時將噬菌體展示技術(shù)篩選獲得的高親和力抗體序列分別與質(zhì)譜數(shù)據(jù)和高通量數(shù)據(jù)進行匹配。實驗結(jié)果顯示,3個重組質(zhì)粒經(jīng)誘導表達,其中除VHH-410994蛋白不表達外,其余2個蛋白VHH-437310、VHH-737446均表達,其大小在20 kD左右。經(jīng)間接ELISA表明VHH-737446與原核CD47具有結(jié)合活性但與真核CD47不結(jié)合。噬菌體展示技術(shù)篩選獲得的抗體序列僅能與高通量數(shù)據(jù)庫成功匹配獲得6個序列且在數(shù)據(jù)庫中低頻出現(xiàn)。
【圖文】：

注:A: M: 非預染 Marker (14.4~116.0 kDa); 1 : 純化的 CD47 蛋白; B ;M:預染 Marker(14~120.0 kDa); 2-1 A: 15%SDS-PAGE 檢測 CD47 粗蛋白的純化 B: Western Blot 檢測 CD47 重組蛋白的表達ote: B: M: unstained protein molecular weight marker (14.4-116.0 kDa); 1: purification proteinof CD47 (14-120 kDa); B: M: prestained protein molecular weight marker; 1: Recombinantprotein CD47gure .2-1 A: analysis of purification of CD47 by 15% SDS-PAGE B: analysis of the expressionof CD47 recombinant protein by Western Blot2 抗原 CD47 免疫新疆雙峰駝血清效價測定將純化的 1mg CD7 蛋白免疫新疆雙峰駝，在用 CD47 初次免疫新疆雙峰駝采集免疫前外周淋巴血，并收集血清，，凍存于-80 ℃，初次免疫兩周后以后每一周將抗原 CD47 與不完全弗氏佐劑等體積混合，抗原免疫量 1mg/次，在免

圖 2-2 間接 ELISA 測定 CD47 第五次（A）和第六次(B)免疫駱駝血清抗體效價Fig.2-2 Determination of the anti-CD47 serum titers after the fifth (A) and sixth immunization (B)by indirect ELISA3.3 駱駝外周淋巴細胞 RNA 的提取以及 VHH 片段的獲得
【學位授予單位】：新疆大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 周秉博;郝勝菊;閆有圣;馮喧;劉芙蓉;蔣小慧;;高通量測序技術(shù)在常見遺傳性疾病中的應(yīng)用進展[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2017年11期

本文編號：2596689