【摘要】：研究背景及目的:mTORC1是一種含有mTOR蛋白激酶且對雷帕霉素敏感的蛋白激酶復(fù)合體,是mTOR信號通路的關(guān)鍵組成之一,其整合營養(yǎng)(如氨基酸)、能量、生長因子(如胰島素)等多種信號,在細(xì)胞生長、細(xì)胞周期、生物合成代謝、自噬等眾多生物學(xué)過程發(fā)揮重要作用。而Notch信號通路是一條經(jīng)典的信號通路,其可以通過相鄰細(xì)胞之間的相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織、器官的分化和發(fā)育,Notch信號的異常激活也與眾多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。近年來,已有許多研究證明了mTORC1和Notch信號通路之間存在密切關(guān)聯(lián),但其具體機(jī)制尚不完全清楚。研究兩者間的關(guān)系不僅可以為細(xì)胞的增殖分化以及干性研究等提供新的研究方向,而且可以為腫瘤防治提供新的藥物作用靶點(diǎn),具有重要的理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。我們的研究發(fā)現(xiàn)m TORC1對Notch信號通路特異性轉(zhuǎn)錄因子HES1的蛋白表達(dá)水平具有調(diào)控作用。本研究旨在揭示mTORC1對HES1蛋白表達(dá)水平調(diào)控的分子機(jī)制。研究方法:(1)利用免疫印跡法(Immunoblot)對比研究細(xì)胞在mTORC1不同激活狀態(tài)下Notch信號通路主要分子的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。(2)利用mTORC1特異性抑制劑、蛋白合成抑制劑、蛋白酶體抑制劑以及RT-PCR、免疫印跡等技術(shù)闡明mTORC1究竟是通過調(diào)控HES1 mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成還是蛋白質(zhì)降解的機(jī)制對HES1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控的。(3)利用Cullin Neddylation抑制劑、Cullin1 shRNA靜默、Dominant negative Cullin突變體等研究方法,研究Cullin1依賴性E3泛素連接酶對HES1蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控作用。(4)利用一系列蛋白激酶抑制劑與雷帕霉素的聯(lián)合應(yīng)用,初步揭示GSK3在mTORC1抑制狀態(tài)下HES1降解的作用,進(jìn)而利用Constitutively active GSK3β與HES1共轉(zhuǎn)染以及GSK3βshRNA干擾等方法,進(jìn)一步研究GSK3在mTORC1抑制狀態(tài)下對HES1降解的調(diào)控作用。(5)采用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)方法研究識別并降解GSK3磷酸化底物的E3泛素連接酶FBWX7與HES1是否存在結(jié)合。(6)利用DNA定點(diǎn)突變技術(shù)對HES1潛在的GSK3磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行突變,研究各個(gè)HES1突變體在mTORC1抑制狀態(tài)下的蛋白穩(wěn)定性,從而初步揭示GSK3的磷酸化位點(diǎn),為揭示FBWX7在mTORC1抑制狀態(tài)下降解HES1提供了Phosphodegron的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。研究結(jié)果:(1)mTORC1調(diào)控Notch信號下游的靶基因HES1的蛋白表達(dá)水平,且其調(diào)控水平與基因水平無關(guān)而與蛋白質(zhì)降解水平相關(guān)。(2)mTORC1通過調(diào)控HES1蛋白降解的機(jī)制對HES1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控。在mTORC1激活狀態(tài)下,它維持HES1的蛋白穩(wěn)定性;而在mTORC1抑制狀態(tài)下,HES1被迅速降解。(3)在m TORC1抑制狀態(tài)下,泛素化-蛋白酶體介導(dǎo)了HES1蛋白的降解,而Cullin1依賴性E3泛素連接酶對HES1蛋白穩(wěn)定性具有調(diào)控作用。(4)GSK3β在mTORC1抑制狀態(tài)下對HES1降解產(chǎn)生調(diào)控作用,GSK3可能是mTORC1抑制狀態(tài)下對HES1產(chǎn)生Phosphodegron的重要激酶。(5)識別并降解GSK3磷酸化底物的E3泛素連接酶FBWX7與HES1存在結(jié)合。(6)HES1 S101和S105可能是潛在的磷酸化位點(diǎn),這兩個(gè)位點(diǎn)的丙氨酸突變導(dǎo)致mTORC1抑制狀態(tài)下HES1蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的提高。研究結(jié)論:mTOR信號通路對Noch信號通路的調(diào)控機(jī)制仍不甚明了。本研究發(fā)現(xiàn)在mTORC1活性抑制狀態(tài)下,Notch信號通路下游重要靶基因HES1的蛋白的表達(dá)量顯著下降。mTORC1調(diào)控HES1蛋白穩(wěn)定性是通過Cullin1依賴性E3泛素連接酶實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)GSK3β可能是mTORC1抑制狀態(tài)下磷酸化HES1,負(fù)責(zé)產(chǎn)生Phosphodegron的蛋白激酶,而FBXW7與HES1存在物理結(jié)合,HES1S101和S105可能是潛在的磷酸化位點(diǎn),可能是由FBXW7識別并降解的位點(diǎn)。本研究揭示了mTORC1調(diào)控Notch/HES1信號通路的全新機(jī)制,具有重要的理論價(jià)值和潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【圖文】：

究 mTORC1 對 Notch 信號通路的調(diào)控機(jī)制，我們參照各大文獻(xiàn)，和 TSC2-/- MEF 細(xì)胞中于不同時(shí)間 點(diǎn)加入雷帕霉素，并利t 的方法比較了 Notch 信號通路主要分子的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，檢理不同時(shí)間點(diǎn)后各分子表達(dá)水平的變化�；蚯贸� TSC2-/- MEF 其 mTORC1 高度激活，如圖 1A 中 P70比所示。雷帕霉素處理不同時(shí)間點(diǎn)后，mTORC1 活性均受到抑制通路相關(guān)的 Notch1 蛋白和 Numb 蛋白的變化并不顯著。然而，N游靶蛋白 HES1 的表達(dá)水平卻顯著下降，甚至在 6h 的時(shí)間點(diǎn)中 H水平也顯著降低，，由此，我們初步推斷 mTORC1 有可能調(diào)控了 H。ch1ycin0 h 6h 12h 24h 48h 0 h 6h 12h 24h 48hTSC2+/+ MEF TSC2-/- MEF

江 蘇 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文我們又利用 TSC1+/+和 TSC1-/- MEF 重復(fù)了上述實(shí)驗(yàn)，也得到（如圖 1B 所示），HES1 蛋白的表達(dá)水平不僅在 TSC1-/- 細(xì)且雷帕霉素處理顯著降低 HES1 的表達(dá)水平，由此，我們進(jìn)一控了 HES1 蛋白的表達(dá)。h1TSC1-/- MEFycin 0 h 6h 12h 24h 48h0 h 6h 12h 24h 48hTSC1+/+ MEF
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 沈文;午睡別超過1小時(shí)[J];海南礦冶;1999年04期

2 王春喜,臧廣生,賈潤英,王嘉桔,姚迪;中西醫(yī)結(jié)合治療血栓閉塞性脈管炎中紅細(xì)胞免疫狀態(tài)的動(dòng)態(tài)觀察[J];中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志;1998年01期

3 董靜;《中亞》知識接力賽[J];甘肅教育;1998年Z2期

4 ;乘車不宜閉目養(yǎng)神[J];農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與技術(shù);1998年01期

5 林名勤;納洛酮對20例新生兒缺氧性損傷恢復(fù)期抑制狀態(tài)的療效觀察[J];臨床兒科雜志;1998年06期

6 ;生活中的科學(xué)[J];新疆農(nóng)墾科技;1986年01期

7 銘沙;早晨不宜干食[J];農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與技術(shù);1998年07期

8 ;生活中的科學(xué)[J];新疆農(nóng)墾科技;1992年04期

9 楊梓宸;;中老年人晨醒后有七忌[J];開卷有益(求醫(yī)問藥);2009年11期

10 柯春榮;早晨干食 有害健康[J];家庭科技;2003年02期

相關(guān)會議論文 前2條

1 謝啟舜;;談老年人失眠[A];探索中國特色養(yǎng)老之路——江蘇2003·健康老齡化和養(yǎng)老模式文選[C];2003年

2 張耀洲;金勇豐;吳祥甫;;蠶表達(dá)人粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子及其口服藥物的研究[A];中國生物工程學(xué)會第三次全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2001年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 ;睡眠過多或過少皆易發(fā)胖[N];中國醫(yī)藥報(bào);2003年

2 張乾;風(fēng)不練 雨練 霧不練 雪練[N];中國醫(yī)藥報(bào);2004年

3 蔡瑞芳;以衣代被不可取[N];中國物資報(bào);2000年

4 興元 九衛(wèi);貪睡懶覺不利健康[N];檢察日報(bào);2001年

5 小李;人睡著了為什么會做夢[N];衛(wèi)生與生活報(bào);2007年

6 梅松;早餐干食害健康[N];保健時(shí)報(bào);2004年

7 穩(wěn)夷;孩子“貪吃”害處多[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報(bào);2006年

8 譚興元;睡多了也有害[N];保健時(shí)報(bào);2003年

9 副研究員 蒲昭和;睡個(gè)“回籠覺”又何妨[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報(bào);2008年

10 ;中年人晨醒后六注意[N];保健時(shí)報(bào);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 呂品;mTORC1對HES1蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控作用及其機(jī)制研究[D];江蘇大學(xué);2018年

本文編號：2596550