【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群感染所導(dǎo)致的一種人畜共患病,嚴重威脅著人類健康,是世界性的公共衛(wèi)生難題。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道,近年來結(jié)核病“死灰復(fù)燃”,全世界約三分之一的人為結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者,每年新增感染者上千萬,死亡人數(shù)高達數(shù)百萬。中國是全球第三大結(jié)核病高負擔(dān)國家,感染人數(shù)、患病人數(shù)和死亡人數(shù)均高于全球平均水平。近年來,耐多藥(Multidrug-resistant tuberculosis,MDR)、廣泛耐藥(Extensively drug-resistant tuberculosis,XDR)以及HIV共感染等問題的出現(xiàn)與擴散更加劇了結(jié)核病的嚴峻形勢。分枝桿菌細胞壁含有大量脂質(zhì),約占細胞干重的30~40%,但它們的生物功能、合成途徑及其錯綜復(fù)雜的結(jié)構(gòu)仍然是個謎。研究表明,在感染過程中,結(jié)核分枝桿菌可積累大量的脂質(zhì)(包括來自宿主細胞的脂類),并以三酰甘油(TAG)形式儲存起來,以維持細菌生存。處于非復(fù)制階段的結(jié)核分枝桿菌可在宿主細胞內(nèi)持續(xù)存活幾十年,尤其難以消滅。在重新激活的情況下,TAG被用作能量來刺激細胞恢復(fù)到復(fù)制狀態(tài),從而導(dǎo)致活性感染。結(jié)核分枝桿菌基因組中有大量的基因編碼脂質(zhì)代謝相關(guān)的酶類(約250個),其中,脂解酶可水解細菌儲存的脂質(zhì),為結(jié)核分枝桿菌生存提供能量。這些酶主要分為五大家族:Lip家族、磷脂酶家族、角質(zhì)酶家族、β-內(nèi)酰胺酶家族和PE/PPE家族。它們在分枝桿菌的生命周期、持留和毒力中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。深入研究這些酶的特性與功能,將有助于開發(fā)新型抗結(jié)核藥物和診斷試劑。本課題以結(jié)核分枝桿菌H37Rv中Lip家族成員Rv1076(LipU)為研究對象,深入探索了LipU的酶學(xué)特性及功能�；贚ipU與激素敏感型家族脂酶(HSL)一樣,都具有保守的五肽模序“GXSXG”而被注釋為脂酶/酯酶。為了確定Rv1076的酶學(xué)特性及功能,我們對該蛋白進行了表達純化,并測定其活性、酶學(xué)特性及酶學(xué)動力學(xué)參數(shù);然后通過定點突變來驗證LipU的活性位點殘基。同時,將其在恥垢分枝桿菌中的同源基因進行了敲除,以探索LipU的功能;通過細胞因子檢測來揭示LipU在宿主免疫應(yīng)答中的作用。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),LipU對短鏈的對硝基苯酚酯具有高度的催化活性,其最適溫度和pH分別為40℃、pH 8.0。LipU的酶活、Km和Vmax值分別為176.7 U/mg,1.73μM和62.24μM/min;離子型表面活性劑對LipU的活性影響較大;將其活性位點Ser140,Asp244和His269突變后,酶活幾乎完全喪失。Rv1076在饑餓處理下顯著上調(diào);將該基因敲除后,恥垢分枝桿菌對碳源的利用能力降低,表明LipU對于結(jié)核分枝桿菌在脅迫條件下的生存具有關(guān)鍵作用。我們將重組蛋白rLipU與巨噬細胞THP-1共孵育后,檢測到細胞因子TNF-α和IL-12顯著上調(diào),由此表明,LipU參與了宿主免疫應(yīng)答,具有良好的免疫原性。本研究詳細地闡釋了結(jié)核分枝桿菌LipU的特性與功能,有助于提高大家對Lip家族的認識,并且為其他脂酶的研究提供了參考,為開發(fā)新型抗結(jié)核病藥物和診斷試劑提供新思路。
【圖文】：

第 1 章 綜述多態(tài)性串聯(lián)重復(fù)序列）[18, 19]，并且發(fā)現(xiàn)它們對應(yīng)于 PE 和 PPE 家族 3′端的部分序列，從而誕生了 PE/PPE 超家族（包含 PE-PGRS、PE-MPTR、PE 和 PPE 四個亞家族）。該家族成員大部分為分泌蛋白，在免疫逃逸、抗原變異和致病性方面發(fā)揮著重要作用，是疫苗和診斷試劑理想的候選分子。結(jié)核分枝桿菌與其他細菌的根本區(qū)別還在于，，Mtb 很大一部分基因組被用來編碼脂肪合成和分解的酶，如圖 1-1所示，預(yù)計有 250 多個參與脂肪酸代謝的酶類[15]，其數(shù)目是大腸桿菌的 3 倍。在結(jié)核分枝桿菌感染過程中，這些酶可能參與宿主脂質(zhì)的水解，從而為細菌提供能量，維持 Mtb 在胞內(nèi)的存活。因此，抑制這些酶的活性是干預(yù)性治療和免疫調(diào)節(jié)的良好策略[20]。

圖 1-2 脂酶的催化作用Fig. 1-2 The catalytic action of lipases.廣泛分布于自然界中，最早發(fā)現(xiàn)于 1834 年，迄今已有一百多年，已發(fā)現(xiàn)有多種生物包括植物、動物和微生物都可以產(chǎn)生脂酶酶由于具有以下特征而被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用一般不需要輔酶因子參與[32]；2）在有機溶劑中十分穩(wěn)定；特異性；4）高度的異構(gòu)體選擇性[33]。根據(jù)氨基酸序列的相似可分為 8 個家族（I-VIII），它們的來源與特征如下表所示。表 1-1 微生物脂酶分類Table 1-1 Families of bacterial lipolytic enzymes主要來源 特征描述綠膿假單胞菌莢殼伯克霍爾德氏菌熒光假單胞菌枯草芽孢桿菌嗜熱脂肪芽孢桿菌等又稱為“True Lipase”，是由傳統(tǒng)意義上的假單胞菌屬脂酶，因為它是第一個被研究并在工業(yè)中占優(yōu)Lipase 而得名。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R378.911

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1 李春燕;結(jié)核分枝桿菌脂解酶Rv1076（LipU）促進細菌生存及宿主細胞因子的表達[D];西南大學(xué);2018年

本文編號：2595529