【摘要】：目的:明確凋亡相關(guān)蛋白3(apoptosis related protein 3,APR3)的亞細(xì)胞學(xué)定位,并探討其在細(xì)胞凋亡和自噬中的作用。方法:采用生物信息學(xué)方法對(duì)APR3蛋白的信號(hào)肽、跨膜區(qū)、糖基化情況進(jìn)行預(yù)測,并采用Real-time PCR和Western blot檢測APR3在小鼠各器官組織及多種細(xì)胞株中的表達(dá)。利用Percoll法蔗糖密度梯度離心技術(shù)獲得小鼠肝臟組織溶酶體組份,并進(jìn)行Western blot分析,檢測APR3蛋白與溶酶體膜標(biāo)記蛋白LAMP1在各亞細(xì)胞組份及溶酶體中的豐度;采用免疫熒光共聚焦方法探討APR3與LAMP1或溶酶體示蹤劑Lyso-Tracker Red共同定位情況,以及構(gòu)建的APR3蛋白真核表達(dá)載體(pFUGW-APR3)表達(dá)的外源性APR3蛋白的亞細(xì)胞定位特征。APR3表達(dá)載體(pFUGW-APR3)和沉默載體(pLL3.7-APR3)轉(zhuǎn)染NIH 3T3細(xì)胞,采用CCK-8和xCELLigence活細(xì)胞計(jì)數(shù)法、碘化丙啶染色細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)等,檢測APR3對(duì)細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞周期、細(xì)胞溶酶體膜通透性、溶酶體腔pH、溶酶體腔多種酸性水解酶活性(如組織蛋白酶、酸性磷酸酶、酸性脂酶和β-半乳糖苷酶等)等的影響;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況,采用透射電鏡技術(shù)檢測細(xì)胞形態(tài)的變化;采用Western blot法檢測APR3對(duì)凋亡相關(guān)蛋白BAX、BAD、BCL-2和cleaved caspase 3表達(dá)的影響,以及自噬相關(guān)標(biāo)記蛋白Beclin1和Map1LC3B表達(dá)的影響;利用小劑量Rapamycin刺激后,觀察APR3蛋白對(duì)phos-mTOR和p62蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示APR3是一個(gè)含有信號(hào)肽、單重跨膜的糖基化蛋白,Real-time PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)其在多種組織器官和細(xì)胞株中均有表達(dá),其中在小鼠脾臟、腎臟、肝臟、肺、脂肪組織和部分腫瘤細(xì)胞株中具有相對(duì)較高的表達(dá)。對(duì)亞細(xì)胞器組份的Western blot檢測發(fā)現(xiàn)APR3蛋白與LAMP1蛋白表達(dá)具有高度的重疊,免疫熒光雙染色結(jié)果也顯示APR3和LAMP1具有相同的細(xì)胞學(xué)定位特征,并且與溶酶體示蹤劑Lyso-Tracker Red具有相同的細(xì)胞器定位;NIH 3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源表達(dá)質(zhì)粒后免疫熒光染色顯示外源性APR3與Lyso-Tracker Red具有相同的細(xì)胞器定位,并且出現(xiàn)部分定位失真現(xiàn)象,即在細(xì)胞膜中亦出現(xiàn)表達(dá)。NIH 3T3細(xì)胞株中外源性APR3蛋白過表達(dá)降低細(xì)胞的增殖活力,細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯,阻滯于G1/S期,同時(shí)伴細(xì)胞周期蛋白cyclin D1表達(dá)下降,細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子BAX、BAD和cleaved caspase 3表達(dá)升高,凋亡抑制因子BCL-2表達(dá)下調(diào),自噬相關(guān)標(biāo)記蛋白Beclin-1和Map1LC3B表達(dá)增加;外源性APR3蛋白過表達(dá)還使細(xì)胞溶酶體膜通透性增加,溶酶體腔pH降低,溶酶體腔組織蛋白酶B、酸性磷酸酶、酸性脂酶和β-半乳糖苷酶活性增加;與此相反,APR3基因沉默則使溶酶體膜通透性顯著下降,溶酶體腔pH升高,但不影響溶酶體腔相關(guān)酶活性;小劑量Rapamycin使APR3過表達(dá)細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)標(biāo)記蛋白的表達(dá)發(fā)生進(jìn)一步變化(BAX升高、BCL-2下降、Beclin 1和Map1LC3B表達(dá)增加),伴隨著Phos-mTOR和p62蛋白表達(dá)的進(jìn)一步下降。結(jié)論:APR3蛋白是一個(gè)定位于溶酶體膜的全膜蛋白;APR3蛋白過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖活力下降,cyclin D1表達(dá)下降和細(xì)胞周期阻滯(G1/S期),細(xì)胞凋亡與自噬增多,并對(duì)Rapamycin的敏感性增加。
【圖文】：

通大學(xué)博士學(xué)位論文 APR3 蛋白的亞細(xì)胞學(xué)定位及其在細(xì)胞凋亡和自噬中信號(hào)肽預(yù)測利用 expasy 信息分析工具獲得信號(hào)肽預(yù)測效果，如圖 1-1 所示。asure Position Value Cutoff signal peptide?x. C 26 0.628x. Y 26 0.700x. S 22 0.876an S 1-25 0.768D 1-25 0.737 0.450 YES=Sequence SP='YES' Cleavage site between pos. 25 and 26: ALA-LP D=0toff=0.450 Networks=SignalP-noTM、結(jié)果R3的生物信息學(xué)分析

圖 1-2. APR3 蛋白跨膜區(qū)分析Figure 1-2. Analysis transmembrane region of APR3 protein由圖 1-2 分析表明，，APR3 顯示有 2 個(gè)跨膜區(qū)，定位于膜上。其跨膜序于“FSLLMFFGILGSTTLAISILLWG”氨基酸序列中。糖基化分析tput for ' NM_027855.3' NM_027855.3 Length: 223SGGSRAAALLLVLGVERALALPEICTLCPGGMHNLSRVAAYCEDTSKLMQARCCLNQKGTILGLDLQNCSLKDPG 8AYTAIIIDLQANPLKDDLANTFRGFTQLQTLILPQDVPCPGGSNAWDNVTSFKDKQICQGQRDLCNSTGSPEMCP 16ASDGPGLLQCVCADGFHGYKCMRQGSFSLLMFFGILGSTTLAISILLWGTQRRKAKAS.................................N.................................N....... 8...............................................N........................... 16.......................................................... 24shold=0.5)
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2;Q811.4

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 任智;細(xì)胞凋亡的研究現(xiàn)狀[J];四川師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2000年04期

2 羅琦,王建華,王遠(yuǎn)亮,潘君;金屬離子在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用[J];重慶大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2003年08期

3 方曉陽,盛偉;細(xì)胞凋亡的概念來源及其研究進(jìn)展[J];生命的化學(xué);2003年02期

4 田輝凱,姚小皓,李學(xué)軍;非細(xì)胞體系在細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用[J];生命的化學(xué);2003年02期

5 葉玲玲,陳昭烈;動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中細(xì)胞凋亡的檢測與控制[J];中國生物工程雜志;2003年08期

6 龍泉,邢婉麗;Jurkat細(xì)胞凋亡的實(shí)時(shí)電旋轉(zhuǎn)芯片檢測[J];生物物理學(xué)報(bào);2005年01期

7 楊竹林,伍漢文;細(xì)胞凋亡調(diào)控因素有關(guān)基因的研究[J];國外醫(yī)學(xué)(生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè));1997年02期

8 劉恩梅,楊錫強(qiáng);細(xì)胞凋亡及其影響因素[J];重慶醫(yī)學(xué);1998年01期

9 金梅林,陳煥春;細(xì)胞凋亡及基因調(diào)控在獸醫(yī)病毒學(xué)領(lǐng)域研究動(dòng)態(tài)[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2000年04期

10 何靜妹;細(xì)胞的自殺行為——細(xì)胞凋亡[J];邯鄲醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校學(xué)報(bào);2000年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 陳穎麗;李前忠;;不同亞細(xì)胞位置的細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性分析[A];第十一次中國生物物理學(xué)術(shù)大會(huì)暨第九屆全國會(huì)員代表大會(huì)摘要集[C];2009年

2 孫英麗;趙允;朱山;翟中和;;植物細(xì)胞凋亡及其機(jī)理的研究[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第七次會(huì)議論文摘要匯編[C];1999年

3 劉二龍;袁慧;;鋅與細(xì)胞凋亡[A];2003全國家畜內(nèi)科學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文專輯[C];2003年

4 邱潔;高海青;;鋅在細(xì)胞凋亡中的作用研究進(jìn)展[A];山東省微量元素科學(xué)研究會(huì)第三屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2006年

5 俞雅萍;;細(xì)胞凋亡的機(jī)制及途徑和影響因素[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2006年

6 于青;袁偉杰;姚建;;晚期糖基化終末產(chǎn)物引起足細(xì)胞凋亡的機(jī)制[A];2007年浙滬兩地腎臟病學(xué)術(shù)年會(huì)資料匯編[C];2007年

7 季宇彬;尹立;汲晨鋒;;調(diào)控細(xì)胞凋亡的線粒體因素[A];腫瘤病因?qū)W研究與中西醫(yī)結(jié)合腫瘤綜合診療交流研討會(huì)論文集[C];2009年

8 吳經(jīng)緯;湯長發(fā);;運(yùn)動(dòng)中細(xì)胞凋亡的線粒體變化特征[A];湖南省生理科學(xué)會(huì)2006年度學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2007年

9 蒲小平;李長齡;屠鵬飛;宋志宏;;中藥肉叢蓉成分抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[A];第七屆全國生化藥理學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2000年

10 江鍵;宋誠榮;崔黎麗;方影;王小平;;靜電場對(duì)細(xì)胞凋亡作用的初步探討[A];中國物理學(xué)會(huì)第九屆靜電學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2000年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 商?hào)|;“細(xì)胞凋亡”與臨床醫(yī)學(xué)[N];中國醫(yī)藥報(bào);2001年

2 張志軍;細(xì)胞凋亡與中醫(yī)藥[N];中國醫(yī)藥報(bào);2002年

3 ;“細(xì)胞凋亡療法”正逐步成為治療癌癥的新途徑[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2002年

4 記者張建松;治療癌癥新途徑：細(xì)胞凋亡療法[N];科技日?qǐng)?bào);2002年

5 李明輝;“細(xì)胞凋亡”治癌癥[N];醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2002年

6 洪敏;細(xì)胞凋亡研究引人關(guān)注[N];中國醫(yī)藥報(bào);2008年

7 陶春祥;細(xì)胞凋亡對(duì)心臟疾病的影響[N];中國醫(yī)藥報(bào);2003年

8 本報(bào)實(shí)習(xí)記者 梁媛媛;薛定：發(fā)現(xiàn)癌癥“開關(guān)”[N];北京科技報(bào);2010年

9 高書明;誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[N];中國醫(yī)藥報(bào);2004年

10 勇匯;中藥誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展[N];中國醫(yī)藥報(bào);2002年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 楊利;系列多氮類化合物的抗腫瘤活性研究[D];武漢大學(xué);2012年

2 張浩;從分子、細(xì)胞和動(dòng)物水平研究鉛誘發(fā)氧化損傷及細(xì)胞凋亡的效應(yīng)與機(jī)理[D];山東大學(xué);2015年

3 何欣怡;家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis）抑制家蠶BmN細(xì)胞凋亡的功能研究[D];浙江大學(xué);2015年

4 馮全服;從線粒體途徑研究川芎嗪誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡效應(yīng)機(jī)制[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2015年

5 張曉倩;高糖誘導(dǎo)Bim蛋白高表達(dá)而促腎近曲小管上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制探討[D];山東大學(xué);2015年

6 孫健瑋;PTEN基因負(fù)調(diào)控Raf1磷酸化的作用及其對(duì)PC3細(xì)胞凋亡的影響[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2014年

7 徐林艷;腫瘤細(xì)胞凋亡過程中TNFRSF10B和CFLAR調(diào)控機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

8 樊慶端;生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的建模與動(dòng)力學(xué)行為研究[D];上海大學(xué);2015年

9 王德選;WNK_3對(duì)鈉氯協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)子的調(diào)節(jié)及在胚腎細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

10 葉嘉;Nogo-B在急性肺損傷肺泡上皮細(xì)胞凋亡中的作用[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 曹璐璐;2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)對(duì)人胚腎細(xì)胞(HEK293)的毒理效應(yīng)及作用機(jī)制研究[D];中國科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所;2015年

2 張薇;蒜頭果蛋白誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡的研究[D];云南民族大學(xué);2015年

3 唐建國;視黃醇X受體出核抑制對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

4 安璐;3-氯-1,2-丙二醇細(xì)胞毒性及其誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡途徑探究[D];江南大學(xué);2015年

5 楊翔;Procaspase-8的異常表達(dá)抑制TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[D];昆明理工大學(xué);2015年

6 張昌明;I3C通過調(diào)控p53泛素化對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡的影響[D];延邊大學(xué);2015年

7 彭涵;共軛亞油酸對(duì)仔豬脂肪細(xì)胞凋亡的影響[D];西南大學(xué);2015年

8 李立輝;ΔFosB通過MMP-9調(diào)控山羊乳腺上皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

9 楊鑫鋮;Hedgehog信號(hào)通路在大鼠急性胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡中的作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

10 賈瓊瓊;MicroRNA-214對(duì)H_2O_2損傷L6骨骼肌成肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2594654