【摘要】：目的:FoxP3過表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染小鼠骨髓源imDC可以誘導(dǎo)免疫耐受,產(chǎn)生的外泌體具有多種優(yōu)點(diǎn),是潛在的治療方案。本實(shí)驗(yàn)采用FoxP3過表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染小鼠骨髓源imDC,分離其產(chǎn)生的外泌體,并對其進(jìn)行鑒定與蛋白分析。方法:1小鼠骨髓源性imDC細(xì)胞的培養(yǎng)以及純化在無菌條件下剝離小鼠股骨,細(xì)胞培養(yǎng)液沖出骨髓,裂解紅細(xì)胞,收集剩余細(xì)胞,加入含胎牛血清和細(xì)胞刺激因子的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別于第48h、第96h更換培養(yǎng)液,第6天收集細(xì)胞,計(jì)數(shù),每10~8個細(xì)胞加入100μl CD11c免疫磁珠和400μl buffer置于4℃冰箱孵育15min,分選,收集陽性細(xì)胞。2 FoxP3過表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染imDC純化的imDC離心,倒掉大部分細(xì)胞上清。按照轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)MOI=500加入相應(yīng)病毒量培養(yǎng)15min。以細(xì)胞濃度約10~5/ml種于24孔板中培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞,洗滌,用含無外泌體胎牛血清的RPMI-1640繼續(xù)培養(yǎng)72h。3 imDC分泌的FoxP3表達(dá)鑒定熒光顯微鏡動態(tài)觀察細(xì)胞培養(yǎng)過程中FoxP3表達(dá)狀況。細(xì)胞培養(yǎng)至72h,收集細(xì)胞,Western-blot檢測細(xì)胞FoxP3表達(dá)。4 imDex分離純化收集細(xì)胞混懸液,離心除去細(xì)胞以及細(xì)胞碎片,加外泌體提取試劑盒,混勻,室溫靜置12h,離心收集外泌體。5 imDex鑒定電子顯微鏡觀察imDex形態(tài),Western-blot檢測imDex特異性標(biāo)記CD63。6 imDex FoxP3蛋白分析Western-blot檢測imDex FoxP3表達(dá)。結(jié)果:1 imDC形態(tài)觀察細(xì)胞培養(yǎng)第48h:形狀不規(guī)則,貼壁生長。第96h:細(xì)胞開始出現(xiàn)突起,集落生長。第6天:細(xì)胞有細(xì)小樹突狀突起,半懸浮生長,符合imDC生長形態(tài)。免疫磁珠分選后觀察:細(xì)胞活力較好,絕大部分細(xì)胞具有細(xì)小樹突狀突起。2轉(zhuǎn)染后imDC FoxP3表達(dá)鑒定熒光顯微鏡示:轉(zhuǎn)染后第12h細(xì)胞活力良好,大部分細(xì)胞開始出現(xiàn)熒光,持續(xù)至第72h熒光表達(dá)呈高峰,細(xì)胞活力變差,部分死亡。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)第72h,Western-blot顯示:與對照組(等滴度同體積空白腺病毒)相比,FoxP3過表達(dá)腺病毒組FoxP3表達(dá)明顯升高(P0.05)。3小鼠骨髓源imDex鑒定透射電鏡示:外泌體呈圓形或橢圓形,直徑約為50-100nm左右,符合外泌體形態(tài)特征。Western-blot檢測:外泌體特異性標(biāo)志蛋白CD63呈高表達(dá),結(jié)合形態(tài)學(xué)特征,進(jìn)一步確定提取物為外泌體。4 imDex FoxP3檢測結(jié)果轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)第72h,Western-blot顯示:與對照組(等滴度同體積空白腺病毒)相比,FoxP3過表達(dá)腺病毒組產(chǎn)生的imDex FoxP3表達(dá)明顯升高(P0.05),證明外泌體攜帶imDC來源的免疫抑制因子。結(jié)論:1本實(shí)驗(yàn)成功利用FoxP3過表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染小鼠骨髓源性imDC,并檢測到imDC中FoxP3高度表達(dá)。2本實(shí)驗(yàn)利用電鏡以及Western-bolt的方法,對外泌體進(jìn)行了鑒定。3本實(shí)驗(yàn)成功檢測到FoxP3過表達(dá)imDC所產(chǎn)生的外泌體高表達(dá)FoxP3,證明其攜帶imDC的免疫調(diào)節(jié)信息。4本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性利用imDex小分子可以透過血腦屏障等優(yōu)點(diǎn),為MS等神經(jīng)免疫疾病的治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1 細(xì)胞培養(yǎng)第 48hof Cell Culture: The cells are small, there is no dendrcolonies

圖 1 細(xì)胞培養(yǎng)第 48h圖 1 細(xì)胞培養(yǎng)第 48hof Cell Culture: The cells are small, there is no dendrcolonies
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳榮華;;Th22細(xì)胞及其細(xì)胞因子在急性淋巴細(xì)胞白血病表達(dá)水平及其意義分析[J];中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2013年04期

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本文編號：2594311