【摘要】：目的:人類免疫缺陷病毒(HIV)是引起人類獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的病原體。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù),HIV的早期診斷對控制其傳播有著至關(guān)重要的意義。本研究采用級聯(lián)的toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)(TMSDR)和非酶的目標物循環(huán)擴增(TRA)實現(xiàn)信號的放大,構(gòu)建雙信號電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)對HIV相關(guān)基因進行高靈敏特異性檢測,以期實現(xiàn)對HIV進行早期診斷。方法:1.電化學(xué)生物傳感檢測系統(tǒng)的構(gòu)建和表征:以目標鏈促發(fā)級聯(lián)的toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)同時啟動非酶的目標物循環(huán)以期實現(xiàn)信號的放大,以聚丙烯酰胺凝膠電泳(PEAG)、熒光分光光度法、電化學(xué)阻抗譜法(EIS)對設(shè)計的方法和傳感器的組裝進行可行性分析和表征。2.電化學(xué)生物傳感檢測系統(tǒng)的條件優(yōu)化:對影響檢測的反應(yīng)條件進行優(yōu)化,主要包括檢測探針的濃度和固定時間、反應(yīng)物的比例、反應(yīng)時間和溫度等。3.電化學(xué)生物傳感檢測系統(tǒng)的性能評價:以方波伏安法(SWV)作為電化學(xué)檢測方法,對傳感器的線性檢測范圍、靈敏度、特異性、準確度以及重復(fù)性進行評價。結(jié)果:1.通過不同方法證明設(shè)計的方法具有可行性,傳感器成功構(gòu)建。2.基于TMSDR和非酶的TRA的電化學(xué)生物傳感系統(tǒng),其線性檢測范圍為1 pM到10 nM,檢測低限為0.88 pM(S/N=3),具有較好的特異性能夠識別單堿基錯配,準確度和重復(fù)性亦較為優(yōu)異。結(jié)論:本研究構(gòu)建了一種電化學(xué)DNA生物傳感器用于高靈敏特異性地檢測HIV相關(guān)基因。本研究構(gòu)建的傳感器具有雙信號、非酶擴增以及反應(yīng)條件溫和的特點。級聯(lián)的鏈置換反應(yīng)和雙重氧化還原標簽的雙信號識別保證了方法的特異性能夠識別單堿基錯配。在稀釋的人血清中亦表現(xiàn)出了很好的檢測能力,說明其具有在復(fù)雜樣本中進行檢測的能力。再者,通過改變檢測探針的序列,可以對其它核酸進行檢測,故其在核酸檢測方面具有較好的應(yīng)用潛力和價值。
【圖文】：

并暴露出 5'末端作為 toehold 區(qū)域與 target 進行雜交。當(dāng)有 target 存在的其與 CS 的 5'末端的 toehold 區(qū)域雜交，TMSDR 促發(fā)核酸鏈的分支遷移，BS 置換下來。隨后，trigger 與 CS 的中間區(qū)域雜交，同樣通過 DNA 的，MB-AS 和 target 均被置換下來，釋放的 target 啟動新一輪反應(yīng)形成了放大的機制。循環(huán)放大機制促使大量帶有信號基團的 MB-AS 釋放，以敏檢測。MB 和 Fc 作為具有電活性的氧化還原標簽在該生物感應(yīng)體系signal-off/on”電化學(xué)信號（如圖 1B）。首先，F(xiàn)c-P1 / P2 雙鏈 DNA 檢過 Au-S 鍵自組裝在金電極的表面。由于 Fc 信號基團靠近電極表面，故的電流信號較強。當(dāng) MB-AS 將 Fc-P1 置換下來形成 MB-AS / P2 雙鏈時信號基團遠離電極，信號減小，同時 MB 信號基團靠近電極，信號增大個信號基團總變化值與 target 濃度的相關(guān)性進行檢測。同時產(chǎn)生兩個氧流信號使得檢測精確且靈敏，可顯著提高方法的檢測性能。

核酸傳感檢測系統(tǒng)的表征光光度法表征實驗 target 置換下來，BS 又可將帶有 FAM 基團的 P3 從光基團與淬滅基團遠離，熒光恢復(fù)。圖 2 中 a 曲線，S混合液，其熒光強度較弱，表明 FAM 基團被 Dabcyl 和熒光探針的混合液中加入 trigger 后，因為背景信號 曲線, 在 SP 和熒光探針的混合液中加入 target 以后，的增幅，，說明 target 將 BS 置換了下來；d 曲線,在 SP 入了 target 和 trigger 后，熒光強度較 b 曲線上升了 550充分說明了無酶的 TRA 和 trigger 對于信號放大的重要
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R373;TP212

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本文編號：2593515