本文關(guān)鍵詞：清熱解毒涼血化瘀法聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療急性肝衰竭模型大鼠及其機(jī)制的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化與鑒定目的:使用全骨髓貼壁培養(yǎng)法篩選大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并使用流式細(xì)胞技術(shù)鑒定其純度。方法:1.分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,采用全骨髓貼壁培養(yǎng),多次傳代的方法純化細(xì)胞:(1)取3-5周齡SFP級SD大鼠,剪開腿部皮膚及肌肉組織,無菌環(huán)境下取出雙側(cè)股骨及脛骨,清理干凈附著組織,剪斷兩端,使用磷酸鹽緩沖液沖出骨髓,1200r/min離心4min后棄上清液,加入以L-DMEM+10%胎牛血清配置的培養(yǎng)液吹打混勻,調(diào)整細(xì)胞密度,種于直徑70mm的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng),每個培養(yǎng)皿接種細(xì)胞數(shù)約為1*106-7。(2)上一步接種的細(xì)胞經(jīng)48h首次全量更換培養(yǎng)液,以后每48h或72h全量換液,待細(xì)胞生長至覆蓋皿底面積的70%-80%時,以0.25胰蛋白酶消化后1:2傳代,傳至第4代備用。2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記的流式細(xì)胞技術(shù)鑒定:取生長狀態(tài)較好的第4代細(xì)胞,胰酶消化,羊血清封閉,洗滌之后相應(yīng)抗體標(biāo)記,上流式細(xì)胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)陽性的CD29、CD44以及表達(dá)陰性的CD34、CD45。結(jié)果:1.成功分離出貼壁生長的細(xì)胞,經(jīng)過傳代培養(yǎng)篩選后得到呈梭形或多角形生長,有偽足,旋渦狀或火焰狀分布的細(xì)胞。2.經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定,CD29細(xì)胞陽性率達(dá)99.2%、CD44細(xì)胞陽性率達(dá)99.4%,CD34細(xì)胞陽性率達(dá)4.5%,CD45細(xì)胞陽性率達(dá)16.9%,符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志。結(jié)論:采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法,經(jīng)過多次傳代能夠從SD大鼠骨髓中分離篩選出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。第二部分:清熱解毒涼血化瘀中藥聯(lián)合BMSCs治療急性肝衰竭模型大鼠機(jī)制的初步研究目的:采用清熱解毒涼血化瘀中藥灌胃聯(lián)合干細(xì)胞移植的方式治療急性肝衰竭模型大鼠,對比僅采用干細(xì)胞移植方法治療的效果,通過:1.檢測血清肝功能、肝損傷相關(guān)細(xì)胞因子(TNF-α、IL-10)等指標(biāo);2.觀察肝組織病理切片以及熒光標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在肝內(nèi)的定植情況;初步研究清熱涼血解毒化瘀中藥聯(lián)合干細(xì)胞移植治療肝衰竭的效果和機(jī)制。方法:1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的熒光標(biāo)記將第一部分培養(yǎng)得到的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用胰蛋白酶消化,制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整濃度后用熒光標(biāo)記劑CM-Dil標(biāo)記細(xì)胞。2.建立急性肝衰竭模型大鼠取體重約為180g-220g清潔級SD大鼠,腹腔注射1.4g/kg的D-gal N,48h后將仍存活的大鼠隨機(jī)抽取5只采集血清及肝組織,檢測血清肝功能指標(biāo)并與正常大鼠比較,驗證造模成功與否。3.急性肝衰竭大鼠的中藥+干細(xì)胞聯(lián)合治療(1)將存活的急性肝衰竭模型大鼠隨機(jī)分為4組(A組:中藥聯(lián)合干細(xì)胞治療組;B組:干細(xì)胞治療組;C組:中藥治療組;D組:模型對照組;)分別做以下處理:○1 A、B兩組:以1%戊巴比妥鈉麻醉,腹部剃毛,消毒、鋪巾后于中上腹部作1個約2cm長的縱行切口,經(jīng)門靜脈輸入熒光標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,每只大鼠輸入細(xì)胞數(shù)量約為1*106個,輸入完畢后逐層關(guān)腹,以無菌紗布覆蓋。○2 C、D兩組大鼠手術(shù)處理同前,找到?門靜脈后經(jīng)門靜脈輸入與A、B組大鼠等體積的用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液。(2)手術(shù)后第1天起,A組大鼠以茵陳四苓顆粒灌胃,B組大鼠灌服等量蒸餾水,C組大鼠以茵陳四苓顆粒灌胃,D組大鼠灌服等量蒸餾水。所有實驗動物自由進(jìn)食,飼普通塊料,飲5%葡萄糖溶液。3.檢驗標(biāo)本的采集及檢測于治療7天后所有實驗動物麻醉后腹腔動脈采血、采集肝組織,制作肝臟病理切片,觀察肝衰竭損傷恢復(fù)情況及干細(xì)胞定植生長情況,檢測血清總膽紅素、谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶、腫瘤壞死因子-a、白介素-10等指標(biāo);通過RT-PCR法檢測肝組織白蛋白、甲胎蛋白等指標(biāo)判斷各組實驗動物肝功能恢復(fù)程度。結(jié)果:1.腹腔注射D-氨基半乳糖48h后大鼠急性肝衰竭模型成功建立,60只實驗大鼠在24h內(nèi)死亡9只,48h內(nèi)共死亡13只,另抽取5只驗證造模效果,剩余35只大鼠進(jìn)入下一步實驗。2.各組實驗動物行手術(shù)后觀察7d,模型組大鼠(D組)活動減少,食欲不振,飲水減少,毛發(fā)蓬亂,尿色深黃,體重減輕,約5d后開始逐漸恢復(fù);各治療組大鼠癥狀表現(xiàn)均較模型組大鼠輕,飲食及活動恢復(fù)較早,約3d后開始逐漸恢復(fù)。各組大鼠生存情況:○1 A組大鼠手術(shù)后1d內(nèi)死亡1只,2d內(nèi)共死亡2只;○2 B組大鼠手術(shù)后1d內(nèi)死亡1只,2d內(nèi)共死亡2只;○3 C組大鼠手術(shù)后1d內(nèi)死亡2只,2d內(nèi)共死亡2只;○4 D組大鼠手術(shù)后1d內(nèi)死亡2只,2d內(nèi)共死亡3只,3d內(nèi)共死亡4只;其余各組大鼠均存活超過7天;3.實驗動物血清炎癥細(xì)胞因子指標(biāo)檢測結(jié)果○1采取治療措施的3組(A、B、C組)大鼠TNF-α水平低于模型對照組(D組),IL-10水平高于模型對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;○2各治療組間比較,A組與B、C兩組比較,TNF-α水平較其他兩組低,IL-10水平較其他兩組高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,但B組與C組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;4.實驗動物血清肝功能指標(biāo)檢測結(jié)果○1各個治療組ALT、TBIL指標(biāo)相比模型組均有明顯改善,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;○2各個治療組之間的肝功能指標(biāo)比較:A組ALT、TBil指標(biāo)相比B組和C組有明顯改善,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;B組上述指標(biāo)相對C組有改善,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。5.肝臟病理切片○1 A組經(jīng)過BMSCs+中藥聯(lián)合治療后,炎細(xì)胞浸潤顯著減少,肝小葉結(jié)構(gòu)恢復(fù),靜脈周圍膽管增生;○2 B組炎癥浸潤亦顯著減少,但匯管區(qū)仍有炎癥浸潤,肝組織結(jié)構(gòu)恢復(fù);○3 C組肝臟結(jié)構(gòu)恢復(fù),但仍有較B組稍多的炎癥細(xì)胞聚集;○4 D組肝組織結(jié)構(gòu)亦能見到恢復(fù),但是炎癥浸潤程度較治療組重;○5熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞:A、B兩組在肝組織內(nèi)可見一定數(shù)量被標(biāo)記的細(xì)胞,但占細(xì)胞總數(shù)中的比例不大。6.各治療組肝組織ALB、AFP含量的RT-PCR及電泳結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示,三個治療組均有ALB及AFP的表達(dá),表達(dá)強(qiáng)度依次為A組、B組、C組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.腹腔一次性注射1.4g/kg D-Gal N能夠成功建立SD大鼠急性肝衰竭模型。2.茵陳四苓顆粒與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植均能夠減輕急性肝衰竭大鼠肝臟的炎癥反應(yīng),促進(jìn)肝功能恢復(fù)和肝再生,中藥與干細(xì)胞聯(lián)合治療的效果好于兩者單獨使用。3.茵陳四苓顆粒與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在聯(lián)合治療急性肝衰竭模型大鼠上有協(xié)同作用,可能是通過兩者共同調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)信號通路和對抗細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)。4.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注入急性肝衰竭大鼠肝內(nèi)可以促進(jìn)肝再生,使肝組織ALB及AFP表達(dá)增高,茵陳四苓顆粒聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療可以加強(qiáng)這一作用。5.本次實驗骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過門靜脈輸入肝臟后在肝內(nèi)見到定植和增殖分化的細(xì)胞數(shù)不多,除實驗操作失誤或熒光標(biāo)記效果不佳之外,可能從一個方面提示:在急性肝衰竭的治療上,BMSCs短期內(nèi)發(fā)揮的療效可能不是由其分化為肝細(xì)胞而達(dá)到促進(jìn)肝再生及恢復(fù)肝功能的效果。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 流式細(xì)胞技術(shù) 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 中藥 急性肝衰竭 肝再生
【學(xué)位授予單位】：四川醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575.3;R-332
【目錄】：

• 本文英漢縮略詞對照表4-5
• 摘要5-12
• ABSTRACT12-18
• 前言18-23
• 第一部分23-32
• 引言23
• 材料與方法23-28
• 結(jié)果28-30
• 討論30-31
• 結(jié)論31-32
• 第二部分32-55
• 引言32
• 材料與方法32-39
• 結(jié)果39-48
• 討論48-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 綜述59-66
• 參考文獻(xiàn)63-66

【引證文獻(xiàn)】

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張進(jìn);黃進(jìn);徐志偉;;補(bǔ)腎填精藥促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的效應(yīng)及機(jī)制研究[A];第六屆全國中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)理論研究學(xué)術(shù)研討會暨第二屆湖南省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會肝病專業(yè)學(xué)術(shù)年會論文集[C];2010年

2 韓海嘯;李軍祥;孟捷;張廠;;調(diào)肝益氣通絡(luò)方藥物血清誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞的研究[A];第二十五屆全國中西醫(yī)結(jié)合消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2013年

  本文關(guān)鍵詞：清熱解毒涼血化瘀法聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療急性肝衰竭模型大鼠及其機(jī)制的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：259365