【摘要】：細(xì)菌中日益嚴(yán)重的抗生素耐藥性問(wèn)題已經(jīng)成為人類面臨的最大健康威脅之一�？股氐臑E用是造成這一問(wèn)題的主要原因。環(huán)境中殘留的抗生素不僅可以形成選擇性壓力賦予耐藥性細(xì)菌生存優(yōu)勢(shì),有利于抗生素耐藥性基因(ARGs)在同種以及異種細(xì)菌之間水平轉(zhuǎn)移;還可以通過(guò)對(duì)載有ARGs的整合子等可移動(dòng)遺傳元件進(jìn)行調(diào)控來(lái)促進(jìn)耐藥基因傳播。Ⅰ型整合子結(jié)構(gòu)較為典型,通常由5'保守區(qū)、可變區(qū)、3'保守區(qū)三部分組成。Ⅰ型整合子的5'保守區(qū)含有Ⅰ型整合酶編碼基因(intI1),特異性重組位點(diǎn)(attI)以及基因盒啟動(dòng)子(Pc)。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)用于本課題研究的大腸桿菌的Pc位于intI1編碼區(qū)內(nèi),Pint位于intI1編碼區(qū)外,Pc,Pint方向相反且有一段重復(fù)序列。這就為整合酶以及基因盒的共調(diào)控提供了一定的依據(jù)。的確,有研究發(fā)現(xiàn)在霍亂弧菌中整合酶和基因盒的表達(dá)是共調(diào)控的。根據(jù)Pc啟動(dòng)子-10區(qū)和-35區(qū)的不同,Pc啟動(dòng)子可分為不同的種類,通過(guò)本實(shí)驗(yàn)前期的工作發(fā)現(xiàn)濟(jì)南水環(huán)境中Pc啟動(dòng)子檢出頻率居于前3位的分別是PcW、PcWTGN-10,PcH1。Pc上游有一段與-10區(qū)部分重復(fù)的序列,該部分為一可能的cAMP-CRPbox,Pint上游-10區(qū)有一典型的LexAbox。cAMP-CRP是碳阻遏調(diào)控途徑的蛋白復(fù)合物,而LexA蛋白為SOS調(diào)控的關(guān)鍵蛋白,因此我們可以推測(cè)SOS途徑或者cAMP-CRP可以對(duì)整合酶和基因盒進(jìn)行調(diào)控。已有研究發(fā)現(xiàn)整合酶可以被SOS途徑和cAMP-CRP途徑共同調(diào)控且兩條途徑是獨(dú)立的。SOS途徑和cAMP-CRP途徑都可以對(duì)環(huán)境壓力做出反應(yīng),而環(huán)境中殘留的抗生素于細(xì)菌而言就是一種環(huán)境壓力。本實(shí)驗(yàn)室歐陽(yáng)潤(rùn)澤發(fā)現(xiàn)recA陰性菌株被微量抗生素誘導(dǎo)之后其整合酶的表達(dá)被誘導(dǎo),這也證明了整合酶可能被cAMP-CRP所調(diào)控。然而環(huán)境中抗生素的殘留以及SOS和cAMP-CRP途徑對(duì)基因盒又有著怎樣的影響呢,立足于這一點(diǎn),本課題將主要就微量抗生素以及cAMP-CRP途徑對(duì)幾種不同的Pc變體的耐藥基因盒的調(diào)控展開(kāi)研究。在實(shí)驗(yàn)室已有的工作基礎(chǔ)上我們使用基因工程技術(shù)敲除了原有實(shí)驗(yàn)菌株的crp基因,得到了 crp陰性菌株(crp-)。然后利用同源重組的原理構(gòu)建了 Pc(PcW、PcWTGN-10,PcH1)及Pint雙向啟動(dòng)子載體,將其轉(zhuǎn)化或敲入到目標(biāo)菌株(依次為recA+,crp+菌株;recA+,crp-菌株;recA-,crp+菌株;recA-,crp-菌株)中。然后使用微量濃度的不同種類抗生素處理轉(zhuǎn)化或者敲入有雙向啟動(dòng)子的菌株,一方面通過(guò)qPCR的方式檢測(cè)微量抗生素處理后實(shí)驗(yàn)菌株crp基因轉(zhuǎn)錄水平的變化,另一方面再通過(guò)qPCR和報(bào)告基因檢測(cè)的方式來(lái)探究微量抗生素處理后相應(yīng)菌株的整合酶和耐藥基因盒的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)微量抗生素處理菌株之后crp的轉(zhuǎn)錄水平均表現(xiàn)出上升趨勢(shì),也就是說(shuō)環(huán)境中殘留的抗生素可以誘導(dǎo)細(xì)菌crp基因的表達(dá),從而使cAMP-CRP復(fù)合物含量升高,進(jìn)而激活cAMP-CRP途徑。部分微量抗生素處理crp+和 crp-菌株之后比較其耐藥基因盒的轉(zhuǎn)錄水平與表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)含有crp+菌株中基因盒轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平高于crp-菌株中,這說(shuō)明部分抗生素可通過(guò)cAMP-CRP途徑對(duì)耐藥基因盒的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。殘留在環(huán)境中的抗生素一方面可通過(guò)調(diào)控整合酶的表達(dá)增強(qiáng)整合酶對(duì)耐藥基因盒的剪接與整合能力,另一方面通過(guò)本課題的研究我們可以發(fā)現(xiàn)環(huán)境中殘留的抗生素還可以通過(guò)誘導(dǎo)耐藥基因盒表達(dá)的方式使細(xì)菌耐藥性提高。本研究將使我們深化對(duì)抗生素誘導(dǎo)調(diào)控抗生素耐藥性的機(jī)制的認(rèn)識(shí),并為抗生素耐藥性的控制提供理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

山東大學(xué)碩士學(xué)位論文逡逑在以上所述幾種整合子類型中，Ｉ型整合子結(jié)構(gòu)是最為典型的（見(jiàn)圖１，２），逡逑通常由？５＇保守區(qū)（５＇0）１＾１＾（１８６抑郵，５’0８）：５＾：８含有三大不可缺少的部分，既逡逑Ｉ型整合酶編碼基因（／故／７）；特異性重組位點(diǎn)（ａ？／）；基因盒啟動(dòng)子（Ｐ。）。②可變逡逑區(qū)（Ｖａｒｉａｂｌｅ邋ｒｅｇｉｏｎ，ＶＲ）：邋ＶＲ區(qū)通常含有一個(gè)或數(shù)個(gè)基因盒，基因盒是由一個(gè)結(jié)逡逑構(gòu)基因及整合性位點(diǎn)組成的一種較小的可移動(dòng)性ＤＮＡ元件。結(jié)構(gòu)基因主要逡逑編碼對(duì)抗生素的耐藥性，目前，有超過(guò)１３０種基因盒已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，這些基因盒可逡逑以賦予幾乎已知所有抗生素［１７］，這些基因盒一般沒(méi)有自身所特有的啟動(dòng)子，而逡逑是由位于５＇ＣＳ的Ｐｃ所啟動(dòng)。ＶＲ區(qū)不屬于埋整合子中必然存在的結(jié)構(gòu)。③３＇保逡逑守區(qū)０３＇￡：0１１８６１＾｛１８６８６１１１６１＾，３＇匚８）：１型整合子的３＇0８通常含有么＠0￡＇（溴化乙淀逡逑耐藥基因）、似／八磺胺類耐藥基因）以及一些明功能未知的開(kāi)放式閱讀框0ＲＦ５［１８］。逡逑Ｉ型整合酶屬于酪氨酸蛋白家族，其催化活性區(qū)域與酪氨酸重組家族相似且逡逑都含有保守性區(qū)域（Ａｒｇ１４６－Ｌｙｓｍ－Ｈｉｓ２７７－Ａｒｇ２８（）－Ｈｉｓ／Ｔｒｐ３（Ｂ）邋［１９］，能夠?qū)刑囟ㄥ义闲蛄械模ǚ腔匚慕Y(jié)構(gòu)）和（回文結(jié)構(gòu)）進(jìn)行識(shí)別

而Ｐｃ位于Ｉ型整合酶編碼區(qū)，故ＳＯＳ途徑可能會(huì)對(duì)基因盒啟動(dòng)子Ｐｅ起到調(diào)控作用。逡逑１．３．邋３邋ＣＡＭＰ－ＣＲＰ途徑對(duì)Ｉ型整合酶表達(dá)的影響逡逑ｃＡＭＰ－ＣＲＰ途徑是細(xì)菌中的關(guān)鍵碳阻遏調(diào)控途徑［２６］（如圖１．４所示），當(dāng)細(xì)菌逡逑的生存環(huán)境中高效碳源（如葡萄糖）存在時(shí)，環(huán)磷腺苷（ｃｙｃｌｉｃＡＭＰ，ｃＡＭＰ）處于較逡逑低的水平，因而利用低效碳源（如幾丁質(zhì)）的基因表達(dá)處于未被激活的狀態(tài)。當(dāng)細(xì)逡逑菌生存環(huán)境中高效碳源含量降低時(shí)，細(xì)菌體內(nèi)腺苷環(huán)化酶（Ａｄｅｎｙｌａｔｅ邋ｃｙｃｌａｓｅ）表達(dá)逡逑水平提高，從而使得ＡＴＰ轉(zhuǎn)化成為ｃＡＭＰ，后者進(jìn)一步結(jié)合ＣＲＰ蛋白形成逡逑ｃＡＭＰ－ＣＲＰ復(fù)合體并激活低效碳源利用所需基因的表達(dá)。該途徑也被發(fā)現(xiàn)能夠?qū)﹀义系纳砉δ茏龀鲰憫?yīng)，，如群體感應(yīng)，細(xì)菌毒力，環(huán)境壓力等。由于ＣＲＰ結(jié)合位逡逑點(diǎn)距離Ｉ型整合子中Ｐｉｎｔ的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)僅有７０堿基對(duì)左右，且低效碳源和外界殘逡逑留抗生素在本質(zhì)上都是環(huán)境壓力，這不禁讓人們懷疑是否ｃＡＭＰ－ＣＲＰ途徑和ＳＯＳ逡逑途徑類似也能夠調(diào)控Ｐｉｎｔ的表達(dá)水平。的確
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R378.21;Q933

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 歐陽(yáng)潤(rùn)澤;水環(huán)境細(xì)菌Ⅰ型整合子整合酶基因與基因盒陣列調(diào)控的研究[D];山東大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2592635