發(fā)布時(shí)間：2020-03-21 00:43

【摘要】：目的研究肺炎支原體MP特異性蛋白之一(P116-609)及其多克隆抗體的制備。并用制備的特異性蛋白聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室先前表達(dá)的P1蛋白特異性抗原一起檢測收集的血清樣本,分析其特異性及其敏感性。方法P116-609蛋白的表達(dá)及ELISA方法的建立:-80度冰箱取出肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株FH-MP,進(jìn)行復(fù)蘇。然后利用MP快速培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),從陽性的培養(yǎng)液中提取基因組DNA作為模板。參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行普通PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得P1116-609目的基因片段。將獲得的目的基因片段進(jìn)行純化,連接到T載體上。待送完公司檢測正確后,進(jìn)行雙酶切純化,然后連接到pQE80-L載體上。將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)大腸桿菌中,進(jìn)行涂板37度恒溫箱中培養(yǎng),挑取單個(gè)菌落進(jìn)入5 ml LB培養(yǎng)基中,放置于250 r/min恒溫?fù)u床上搖菌,16 h后離心留取細(xì)菌沉淀。用DNA質(zhì)粒提取試劑盒,對(duì)其進(jìn)行質(zhì)粒提取。提取的質(zhì)粒進(jìn)行濃度測定,然后進(jìn)行雙酶切。將酶切后的溶液進(jìn)行瓊脂糖電泳,在紫外燈下進(jìn)行觀察拍照。從觀察的結(jié)果好壞挑選出合適的菌液作為菌種保存。目的蛋白的表達(dá):復(fù)蘇保存的菌種,進(jìn)行小量的表達(dá),留取誘導(dǎo)前后的菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳,觀察細(xì)菌目的蛋白的表達(dá)情況,摸索出蛋白表達(dá)的最適合條件。確認(rèn)菌種的目的蛋白表達(dá)符合預(yù)期效果后,進(jìn)行細(xì)菌的大量搖菌,離心沉淀,用100 ml配制好的裂解液B進(jìn)行沖懸,加入蛋白酶抑制劑和細(xì)菌裂解液。總個(gè)過程在冰上操作。放置20 min后,進(jìn)行超聲破碎:300 Hz 5 s,間隔5 s,總時(shí)間18 min。破碎后的液體進(jìn)行10000r/min離心處理,留取上清。然后在沉淀里加入50 l裂解B,沖懸后在進(jìn)行離心,留取上清液保存?zhèn)溆�。再用誘導(dǎo)前后的菌液、上清粗蛋白、包涵體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,再用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色1 h,再用脫色液進(jìn)行脫色12小時(shí)。觀察目的蛋白表達(dá)的情況。最后用配制好的不同酸堿度的洗脫液進(jìn)行洗脫,留取洗脫液,再進(jìn)行SDS-PAGE電泳,對(duì)膠體進(jìn)行染色,觀察目的蛋白主要在哪個(gè)梯度的洗脫液里面。留取主要含有目的蛋白的洗脫液,保存?zhèn)溆�。再用NIE柱進(jìn)一步洗脫純化目的蛋白,保存?zhèn)溆谩６嗫寺】贵w的制備:從安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中購買新西蘭大白兔進(jìn)行分組后,分四周,每周對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行目的蛋白免疫。第一二周蛋白溶液與完全福氏佐劑混合注射,第三四周蛋白溶液與不完全福氏佐劑混合注射耳緣靜脈。最后從新西蘭大白兔耳緣靜脈抽取靜脈血進(jìn)行Western-blot試驗(yàn),觀察多克隆抗體的效果。用ELISA方法進(jìn)行多克隆抗體效價(jià)檢測,確定抗體的效價(jià)以備后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)用。用同樣的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室保存P1蛋白菌種復(fù)蘇,表達(dá)出目的蛋白。然后和自己表達(dá)的P116-609蛋白一起進(jìn)行收集血清的MP檢測,比較單個(gè)特異蛋白檢測和聯(lián)合檢測的特異性和敏感性的差別。結(jié)果成功構(gòu)建好了P116-609基因質(zhì)粒,并較好的進(jìn)行蛋白表達(dá)純化,通過Western-blot方法驗(yàn)證了所表達(dá)的目的蛋白和收集的MP感染病人血清的免疫反應(yīng)性。而與其他的未感染病人血清沒有免疫反應(yīng)性。將表達(dá)的P116-609蛋白與P1蛋白作抗原包被96孔板,和購買的商用試劑盒進(jìn)行特異性和敏感性分析。發(fā)現(xiàn)用這兩種MP特異蛋白聯(lián)合檢測的效果有較大的提高。用自己表達(dá)的蛋白免疫新西蘭大白兔,獲得了較高效價(jià)的此蛋白的多克隆抗體。結(jié)論實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了P116-609目的蛋白對(duì)檢測MP血清有較好的免疫原性。同時(shí)聯(lián)合P1蛋白包被96孔板,對(duì)提高血清檢測的特異性和敏感性都有較大的作用。P116-609目的蛋白免疫新西蘭大白兔獲得的較高效價(jià)的多克隆抗體為后續(xù)的MP黏附抑制試驗(yàn)提供了一些理論幫助。
【圖文】：

圖 1 MP 菌株的培養(yǎng)結(jié)果1：空白對(duì)照組 ；2：菌株培養(yǎng)Fig. 1 MP strain culture results1: blank control group; 2: strain 液的鑒定

圖 2 MP 陽性培養(yǎng)液鑒定結(jié)果M：Marker; 1：擴(kuò)增產(chǎn)物條帶位置Fig. 2 MP positive culture fluid identificationM: Marker; 1:Amplified product band positi
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392-33

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1 劉秀蜀;黃軼U，

本文編號(hào)：2592457