發(fā)布時間：2020-03-20 21:51

【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,以下簡稱金葡菌)是一種常見的革蘭氏陽性致病菌,能夠產(chǎn)生多種毒力因子從而引起人和動物的多種疾病。另外,金葡菌能在一些留置設(shè)備表面上形成生物被膜,使其可以承受各種不利環(huán)境的影響,包括抗生素、營養(yǎng)限制、冷熱以及免疫反應(yīng)等。因此,這種形成生物被膜的能力被認(rèn)為是金葡菌重要的毒力特征之一。此外,生物被膜的耐藥機制也是抗生素不能作為治療金葡菌感染的有效方法的原因之一。因此,目前急需尋找新的治療方法來解決金葡菌感染引發(fā)的一系列難題。本研究的目的是篩選特異性抑制金葡菌生物被膜形成的抑制劑,并進一步探索其抑制作用機制,為將來抗金葡菌生物被膜藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。本實驗通過在96孔板中包被凍干兔血漿模擬生物組織表面,使用金葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213建立體外生物被膜模型。從本實驗室保存的多種天然小分子化合物中進行初步篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)山奈酚具有明顯的抗生物被膜活性。進一步通過倍比稀釋法檢測不同濃度的山奈酚對生物被膜的影響,結(jié)果顯示,山奈酚在較低濃度下顯著的抑制生物被膜的形成,在64μg/ml時可以抑制約80%的生物被膜。此外,在熒光顯微鏡下觀察到山奈酚對生物被膜的抑制作用呈劑量依賴性。MIC實驗結(jié)果顯示,山奈酚的最小抑菌濃度(MIC)1024μg/ml;24h細菌生長曲線分析結(jié)果顯示,64μg/ml,128μg/ml,256μg/ml的山奈酚不影響細菌的生長,由此可見,山奈酚特異性的抑制金葡菌生物被膜的形成,同時并不影響細菌的生長。在金葡菌生物被膜形成的不同階段加入山奈酚,結(jié)果發(fā)現(xiàn)山奈酚特異性的作用于生物被膜的粘附階段。纖維蛋白原結(jié)合實驗進一步驗證了山奈酚通過降低金葡菌的粘附能力從而抑制其生物被膜的形成。為進一步探索山奈酚抑制粘附的機制,通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的方法在體外檢測山奈酚對金葡菌分選酶A(Srt A)活性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)64μg/ml的山奈酚對SrtA的活性抑制47%。另外,通過金葡菌表面蛋白A(SpA)展示實驗,結(jié)果進一步證實山奈酚在64μg/ml時沒有完全抑制SrtA的活性。根據(jù)以上結(jié)果,推測山奈酚還可能存在其他機制抑制粘附。通過透射電子顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)山奈酚處理會導(dǎo)致金葡菌表面蛋白大量減少;熒光定量PCR的結(jié)果進一步顯示,山奈酚下調(diào)了粘附相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。以上實驗結(jié)果表明:山奈酚通過兩種途徑抑制金葡菌生物被膜的粘附階段,一是通過部分抑制SrtA的活性從而減少粘附相關(guān)蛋白的錨定;二是通過下調(diào)粘附相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平從而減少粘附相關(guān)蛋白的表達。綜上所述,山奈酚是一種具有全新機制的金葡菌生物被膜抑制劑,為抗生物被膜藥物的研發(fā)提供了先導(dǎo)結(jié)構(gòu)。
【圖文】：

圖 1 金黃色葡萄球菌生物被膜發(fā)育過程Figure 1 The development of Staphylococcus aureus biofilm1.2.1.1 粘附（Attachment）起始的粘附階段代表了生物被膜開始形成。無論是生物表面還是非生物表面都可以發(fā)生粘附。生物表面上的粘附對于植入醫(yī)療器械生物被膜相關(guān)的感染是十分重要的，這是因為醫(yī)療器械在植入后很快會被宿主基質(zhì)蛋白所覆蓋。金葡菌可以表達多種能夠與宿主基質(zhì)蛋白結(jié)合的表面錨定蛋白，這些蛋白統(tǒng)稱為MSCRAMM（微生物表面成分識別粘附基質(zhì)分子）[12]。MSCRAMM 擁有共同的結(jié)構(gòu)，，其包括暴露的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，通常具有重復(fù)結(jié)構(gòu)的細胞壁跨越結(jié)構(gòu)域和負(fù)責(zé)與細菌表面共價或非共價連接的結(jié)構(gòu)域。其中一部分 MSCRAMM 具有共同的細胞壁靶向基序（LPXTG），但是對于宿主基質(zhì)組分如纖連蛋白，纖維蛋白原，膠原蛋白和細胞角蛋白具有不同的結(jié)合特異性。重要的是，大多數(shù)這些蛋白質(zhì)與細菌細胞壁的連接依賴于分選酶家族，其中最重要的是分選酶 A，它

圖 1.1 金葡菌 ATCC29213 生物被膜抑制劑的篩選結(jié)果Figure 1.1 The result of inhibitor of S.aureus ATCC29213 biofilm2 不同濃度的山奈酚對金葡菌 ATCC29213 生物被膜的抑制效果前面的實驗結(jié)果已經(jīng)證明山奈酚在 512μg/ml 時可以明顯的抑制生物成，接下來為了檢測低于這個濃度的山奈酚是否還可以抑制生物被膜通過定量測值檢測效果。結(jié)果如圖 1.2 所示，山奈酚在較低濃度下便金葡菌 ATCC29213 生物被膜的形成，在 64μg/ml 時便可以抑制約 80%膜。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R378.11

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 于旭紅;王冬;王睿;;耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的研究進展[J];中國臨床藥理學(xué)雜志;2011年04期

相關(guān)會議論文 前1條

1 王良興;;金黃色葡萄球菌致病性研究現(xiàn)狀及進展[A];2011年第三十三屆浙江省呼吸系病學(xué)術(shù)年會暨呼吸疾病診治新進展學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2011年

本文編號：2592250