【摘要】：研究目的 乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)感染可以造成急慢性肝臟疾病,如病毒性肝炎、肝硬化及肝癌等,是危害人類健康的主要病因。我國HBV攜帶者約占全國總?cè)丝诘?0%,是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)。目前臨床使用抗HBV感染的典型藥物有拉米夫定和α-干擾素,但是存在容易誘發(fā)病毒耐藥突變以及副作用較多的問題,限制了療效的發(fā)揮。HBV感染能夠破壞機(jī)體免疫平衡,導(dǎo)致機(jī)體抗病毒免疫功能低下或紊亂,因此,抑制HBV感染需要激活機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答。給易感人群接種乙肝疫苗是預(yù)防HBV感染的有效手段,但是仍有5%-10%的人接種后抗體水平很低或者無應(yīng)答。鋁佐劑是目前唯一可以用于乙肝疫苗的佐劑,雖然較安全,但是因其不能引起機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答,使疫苗在預(yù)防和治療HBV感染方面存在一定的不足,因而研制新型乙肝疫苗佐劑尤為重要。 可德蘭多糖(curdlan)是由產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis)發(fā)酵產(chǎn)生的一種胞外多糖,具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗凝血等活性,因其安全無毒且加熱可成凝膠,被FDA批準(zhǔn)用于食品工業(yè)。研究發(fā)現(xiàn),curdlan硫酸化產(chǎn)物—硫酸化可德蘭(curdlan sulfate)具有良好的抗HIV活性,并已對(duì)其開展Ⅱ期臨床試驗(yàn)。鑒于curdlan和curdlan sulfate二者良好的免疫調(diào)節(jié)及抗病毒活性,我們期望通過本課題研究能夠得到一種具有抗病毒感染作用的免疫調(diào)節(jié)劑,能夠在免疫治療方面發(fā)揮抗HBV感染的作用,同時(shí)還能增強(qiáng)重組乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)的免疫原性,改善疫苗在預(yù)防和治療HBV感染方面的應(yīng)用。 通過研究curdlan sulfate對(duì)小鼠免疫相關(guān)細(xì)胞的影響,考察其體外免疫調(diào)節(jié)活性,采用表面等離子共振(surface plasmon resonance, SPR)技術(shù)研究其結(jié)合的受體；利用HepG2.2.15細(xì)胞上清液濃縮得到的HBV感染HepG2及HepaRG細(xì)胞,研究curdlan sulfate是否可以干擾病毒感染細(xì)胞的過程,并用SPR技術(shù)研究多糖與重組HBsAg的結(jié)合情況；最后,將curdlan sulfate與重組HBsAg聯(lián)合注射BALB/c小鼠,研究其能否增強(qiáng)疫苗的免疫原性,提高產(chǎn)生的抗體水平。本課題研究將為curdlan sulfate開發(fā)成為一種新型抗HBV的免疫預(yù)防及治療劑提供重要的依據(jù)和基礎(chǔ)。 研究方法 1Curdlan sulfate的制備及結(jié)構(gòu)表征 首先我們采用DMSO為溶劑、SO3-吡啶為硫酸化試劑,對(duì)curdlan進(jìn)行修飾。通過控制反應(yīng)溫度,制備出四種curdlan sulfates。采用紅外光譜分析技術(shù)鑒定所制備樣品結(jié)構(gòu),凝膠滲透色譜-多角度激光散射(GPC-MALLS)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定重均分子量(Mw),元素分析儀測(cè)定硫(S)含量。 2Curdlan sulfate體外免疫調(diào)節(jié)活性及機(jī)制的研究 分離小鼠脾淋巴細(xì)胞,采用MTT法測(cè)定curdlan sulfate對(duì)其增殖的影響。采用小鼠RAW264.7細(xì)胞系,研究curdlan sulfate對(duì)巨噬細(xì)胞活化的作用,包括：用細(xì)胞吞噬中性紅和FITC-dextran實(shí)驗(yàn)來分析其對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響；Griess試劑法測(cè)定RAW264.7細(xì)胞經(jīng)curdlan sulfate作用后產(chǎn)生NO的水平；ELISA試劑盒測(cè)定curdlan sulfate對(duì)RAW264.7分泌IL-6、IL-1β及TNF-α細(xì)胞因子的影響；iNOS、IL-6、IL-1β和TNF-a的mRNA水平采用熒光定量PCR (FQ-PCR)進(jìn)行分析。分離并培養(yǎng)小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞(BMDCs),采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)curdlan sulfate對(duì)BMDCs表面成熟標(biāo)志分子表達(dá)的影響。機(jī)制研究采用Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)以及NF-κB的活化情況,并運(yùn)用SPR技術(shù)分析curdlan sulfates與小鼠重組dectin-1的結(jié)合情況。 3Curdlan sulfate體外抗HBV感染活性及機(jī)制的研究 采用PEG8000對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞上清液進(jìn)行濃縮得到HBV,用其感染HepG2及HepaRG細(xì)胞。采用FQ-PCR測(cè)定受感染細(xì)胞中HBV DNA的含量來考察curdlan sulfate對(duì)HBV黏附及入胞過程的影響；用HBsAg及HBeAg ELISA試劑盒檢測(cè)受感染細(xì)胞培養(yǎng)第7d的細(xì)胞上清中HBsAg及HBeAg的含量,來考察curdlan sulfate對(duì)HBV感染細(xì)胞的影響；采用氯酸鈉及硫酸乙酰肝素酶(HPA)處理HepG2及HepaRG細(xì)胞,用FQ-PCR檢測(cè)HBV感染細(xì)胞的情況,并進(jìn)一步用SPR技術(shù)分析curdlan sulfates與重組HBsAg的結(jié)合情況,探討硫酸根在curdlansulfate與HBsAg結(jié)合中的作用,并進(jìn)一步分析其作用機(jī)制。 4Curdlan sulfate體內(nèi)用作乙肝疫苗佐劑的研究 Curdlan sulfate與重組HBsAg聯(lián)合免疫BALB/c小鼠,于第0、14、28d共接種3次,第35d取小鼠脾淋巴細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞巨噬細(xì)胞募集和樹突狀細(xì)胞成熟、CD4+、CD8+分群以及CD4活化情況；取小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)并用HBsAg再刺激,測(cè)定其增殖能力以及分泌IFN-γ、IL-17A、 IL-4、IL-10的水平；流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色法分析小鼠脾淋巴細(xì)胞中Th1、Th2及Th17類細(xì)胞因子的胞內(nèi)表達(dá)情況。另外,在每次免疫后7d收集小鼠血清,用anti-HBs ELISA試劑盒測(cè)定血清中抗體的含量,并用間接ELISA方法測(cè)定anti-HBs免疫球蛋白亞型IgG1、IgG2a的含量,分析小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答類型。 研究結(jié)果 1Curdlan sulfate的制備及結(jié)構(gòu)表征 通過控制反應(yīng)條件,共制備了四種不同分子量及S含量的curdlan sulfates,分別命名為CS1、CS2、CS3及CSⅢ。紅外光譜檢測(cè)結(jié)果顯示,curdlan sulfates在curdlan原有特征吸收峰基礎(chǔ)上,在1258cm-1及816cm-1附近處出現(xiàn)了不對(duì)稱S=O的伸縮振動(dòng)峰及對(duì)稱C-O-S的伸縮振動(dòng)峰,說明curdlan已被成功硫酸化修飾。CS1、CS2、CS3和CSIII的Mw經(jīng)GPC-MALLS測(cè)定為25.87kDa、87.03kDa、171.9kDa和62.54kDa,S含量分別為(4.806±0.30)%、(6.288±0.03)%、(9.340±0.16)%和(7.312±0.11)%。由于CS3含有最高的S含量,下面的活性檢測(cè)均采用CS3樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 2CS3體外免疫調(diào)節(jié)活性與MAPKs途徑有關(guān) CS3促進(jìn)小鼠細(xì)胞脾淋巴細(xì)胞增殖效果顯著,在400μg/mL時(shí)增殖率達(dá)到85.87%,但對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖沒有明顯作用。CS3能增強(qiáng)RAW264.7吞噬中性紅及FITC-dextran的能力,顯著提高細(xì)胞產(chǎn)生NO、IL-6、IL-1β及TNF-α的水平,而且對(duì)細(xì)胞中iNOS、IL-6、IL-1β和TNF-a mRNA的水平也有一定的提高,并呈劑量依賴性。另外,CS3可促進(jìn)BMDCs上調(diào)表達(dá)MHCⅡ、CDllc、 CD40、CD80、CD86分子,產(chǎn)生IL-12和IL-6,刺激細(xì)胞成熟。 Western blot結(jié)果顯示CS3可以通過促進(jìn)MAPKs途徑中Erkl/2和SAPK/JNK的磷酸化來傳遞信號(hào),活化NF-κB,提高iNOS的表達(dá)。SPR技術(shù)表明curdlan sulfates可以與curdlan已知受體dectin-1結(jié)合,說明curdlan經(jīng)硫酸化修飾后主要受體并未改變。 3CS3可以抑制HBV感染的黏附過程 FQ-PCR結(jié)果顯示,CS3可以抑制HBV與HepG2及HepaRG細(xì)胞的黏附,500μg/mL時(shí)的抑制率為分別52.06%、50.43%；HBV感染細(xì)胞后上清中HBsAg及HBeAg的測(cè)定結(jié)果表明,CS3可以抑制HBV對(duì)細(xì)胞的感染。CS3對(duì)黏附過程的抑制率遠(yuǎn)高于其對(duì)HBV感染細(xì)胞的抑制率,說明CS3抗HBV感染的作用階段主要是干擾病毒黏附入胞過程,而不是干擾病毒DNA復(fù)制等過程。 氯酸鈉和HPA作用的細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)硫酸乙酰肝素(HS),用HBV感染分別經(jīng)氯酸鈉和HPA處理后的HepG2細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)病毒感染水平分別降低為陰性對(duì)照的(11.44±2.30)%和(57.17±0.79)%；感染經(jīng)二者處理后的HepaRG細(xì)胞,感染率分別降低為陰性對(duì)照的(9.86±2.29)%和(49.70±±16.07)%。SPR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)curdlan sulfates可以與重組HBsAg結(jié)合,并且硫酸根含量越高,親和力越強(qiáng),提示CS3可能與HBV包膜蛋白結(jié)合,干擾HBV入胞。 4CS3可以增強(qiáng)重組HBsAg免疫原性 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)3次免疫接種后的小鼠脾淋巴細(xì)胞結(jié)果表明,CS3聯(lián)合重組HBsAg免疫小鼠,可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞在脾臟中的募集,F4/80陽性細(xì)胞數(shù)增加,占脾淋巴細(xì)胞總數(shù)的(34.27±±3.47)%,明顯高于商品HB疫苗(HB vaccine)組(**p0.01)；同時(shí)可以刺激樹突狀細(xì)胞的成熟,使細(xì)胞高表達(dá)MHCⅡ、CD11c、CD40和CD86分子；CD4+及CD8+T細(xì)胞亞群在脾淋巴細(xì)胞中的比例明顯升高,與HB vaccine相比有顯著性差異(*p0.05),且CD4+CD69+細(xì)胞數(shù)與單獨(dú)注射HBsAg相比有顯著性增加；分離小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行HBsAg體外再刺激,發(fā)現(xiàn)經(jīng)CS3作用的小鼠脾細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),分泌Th1類型細(xì)胞因子IFN-y的量明顯高于HB vaccine組(**p0.01),CS3在高劑量時(shí)可以促進(jìn)Th2類型細(xì)胞因子IL-4和IL-10的產(chǎn)生,但在低、中劑量時(shí)則作用不明顯甚至有一定的抑制作用,而對(duì)Thl7類細(xì)胞因子IL-17A則沒有明顯作用；采用流式細(xì)胞術(shù)分析胞內(nèi)Thl及Th2類細(xì)胞因子蛋白的表達(dá)情況與細(xì)胞上清中測(cè)定結(jié)果一致。 小鼠血清中anti-HBs檢測(cè)結(jié)果顯示,CS3可以明顯提高HBsAg產(chǎn)生的anti-HBs水平,高劑量組要明顯優(yōu)于HB vaccine組。Anti-HBs免疫球蛋白亞型IgGl的水平經(jīng)CS3作用后下降,IgG2a的水平顯著升高,且Ig2a/IgG1的值與HB vaccine組相比明顯升高(*p0.05),說明CS3用作HBsAg佐劑可以使機(jī)體免疫類型向Thl方向發(fā)展。創(chuàng)新性和結(jié)論 (1)首次采用DMSO/SO3吡啶反應(yīng)體系,制備了不同Mw和S含量的curdlan sulfates,此法安全方便,毒性較低,并且所得樣品的Mw和S含量隨反應(yīng)溫度的升高而降低。 (2)首次研究了curdlan sulfate的體外免疫調(diào)節(jié)活性,樣品CS3可以促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、RAW264.7細(xì)胞活化及BMDCs成熟。 (3)首次采用SPR技術(shù)研究了curdlan sulfate與curdlan已知受體dectin-1的結(jié)合情況,確定dectin-1是curdlan sulfate的主要受體,明確CS3發(fā)揮體外免疫調(diào)節(jié)活性的機(jī)制是通過與免疫細(xì)胞表面dectin-1受體結(jié)合,激活MAPKs信號(hào)通過中的Erkl/2和SAPK/JNK途徑,導(dǎo)致NF-κB向核內(nèi)移位,調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。 (4)首次研究了curdlan sulfate體外抗HBV感染的活性,發(fā)現(xiàn)CS3可以抑制HBV感染HepG2和HepaRG細(xì)胞,并且主要是干擾HBV黏附細(xì)胞的過程。 (5)采用氯酸鈉、HPA處理HepG2和HepaRG細(xì)胞發(fā)現(xiàn)HS在HBV感染細(xì)胞過程中發(fā)揮一定的作用,借助SPR技術(shù)研究curdlan sulfates與重組HBsAg的結(jié)合能力,提示CS3發(fā)揮體外抗HBV感染活性的機(jī)制可能是通過與HBV包膜蛋白結(jié)合,干擾HS-HBV的相互作用,影響HBV與靶細(xì)胞的黏附和融合。 (6)首次進(jìn)行了curdlan sulfate用作乙肝疫苗佐劑的研究,CS3可以提高重組HBsAg的免疫原性,增強(qiáng)小鼠機(jī)體的免疫水平,提高血清中抗體滴度,并且主要誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答向Thl型發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2590688