【摘要】：目的:本課題旨在研究從不同凍存時(shí)間后的脂肪組織中提取脂肪干細(xì)胞在體外培養(yǎng)傳代后誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞,并檢測脂肪干細(xì)胞增殖、成脂分化的能力及分泌的功能,為探究人脂肪干細(xì)胞冷凍保存后的生物學(xué)特性及其應(yīng)用潛能提供了一定的依據(jù)。方法:抽取6例成年女性腹部或大腿脂肪并分離提純,每人得20ml純化脂肪。將一部分脂肪以海藻糖為冷凍保護(hù)劑分別冰凍3個(gè)月、6個(gè)月后復(fù)溫,將新鮮脂肪組織及冰凍脂肪提取的脂肪干細(xì)胞在分別加入完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至第三代,取第三代脂肪干細(xì)胞在6孔板中用含地塞米松,胰島素,吲哚美辛和異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)的培養(yǎng)基和含胰島素的培養(yǎng)基依次培養(yǎng)為成熟的脂肪細(xì)胞。MMT法測定不同組脂肪干細(xì)胞的生長曲線,油紅染色鑒定其成脂分化能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測其表面抗原特性,ELISA法測定第3代脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b FGF)的含量從而研究其增殖、成脂分化及分泌功能。結(jié)果:1、3組中提取的脂肪細(xì)胞培養(yǎng)后第一天就可觀察到有少許多邊形貼壁細(xì)胞,然后這些細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形細(xì)胞。當(dāng)達(dá)到80%融合后可以觀察到細(xì)胞呈長梭形,并呈平行或漩渦狀的有序排列。3組脂肪干細(xì)胞生長曲線無明顯差別。2、3組脂肪干細(xì)胞在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)均可逐漸見到細(xì)胞逐漸變短,變圓,胞質(zhì)內(nèi)可見微小的透亮脂滴,之后脂滴逐漸變大、融合,至14天左右成為成熟脂肪細(xì)胞,此時(shí)細(xì)胞體積變大,可見較大脂滴,有的甚至占據(jù)細(xì)胞的80%以上。3、流式細(xì)胞術(shù)顯示冰凍后脂肪干細(xì)胞仍然高表達(dá)CD44、CD90,與間充質(zhì)干細(xì)胞特征表型相符。冰凍保存后脂肪干細(xì)胞仍然具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特征表型。4、3組脂肪干細(xì)胞傳至第3代后,長至80%融合后,用ELISA法測定其培養(yǎng)基中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b FGF)的含量,VEGF含量各組間P0.05,無明顯差異;HGF含量各組間P0.05,無明顯差異;b FGF含量各組間P0.05,無明顯差異。結(jié)論:冷凍保存6個(gè)月之內(nèi)的人脂肪干細(xì)胞仍具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性,在體外定向誘導(dǎo)下可分化為成熟的脂肪細(xì)胞,可用于輔助脂肪移植。
【圖文】：

10圖3.1 顯微鏡下觀察3組脂肪干細(xì)胞生長情況注：A-D：分別為細(xì)胞提取培養(yǎng)后第1（×100）、4（×200）、10（×100）、16天（×100）；從左到右依次為新鮮組、冰凍3個(gè)月組、冰凍6個(gè)月組3.1.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)的細(xì)胞表面抗原通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各組培養(yǎng)的細(xì)胞表面抗原表達(dá)進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示CD44、CD90 熒光強(qiáng)度為高表達(dá)。均與間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原特性相符合，，表明本實(shí)驗(yàn)各組中所提取的細(xì)胞均屬于脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞，且冰凍 3 個(gè)月、冰凍6 個(gè)月脂肪干細(xì)胞表型特性無明顯差異。（圖 3.2）A 組B ?

C 組圖 3.2 流式細(xì)胞術(shù)分析干細(xì)胞表型結(jié)果注：A、B、C 分別為新鮮組、冰凍 3 個(gè)月組、冰凍 6 個(gè)月組的空白對(duì)照、CD90、CD44 流式結(jié)果3.2.3 MTT 法繪制細(xì)胞生長曲線圖：通過MTT法測得不同時(shí)間時(shí)的吸光值，以生長天數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)（表1），繪制生長曲線圖（圖3.3）。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)比較A組與B組之間P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，A組與C組之間P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。天數(shù) 1 4 7A組 0.22±0.04 0.26±0.02 0.31±0.01B組 0.21±0.05 0.25±0.01 0.29±0.02C組 0.21±0.02 0.23±0.06 0.28±0.04
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張衛(wèi)澤;李國慶;陳永清;馬凌;韓娟萍;;人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其遺傳穩(wěn)定性[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2009年40期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 李澤華;不同凍存時(shí)間后脂肪組織顆粒細(xì)胞存活率的實(shí)驗(yàn)研究[D];南華大學(xué);2016年

2 劉林奇;低氧預(yù)處理的人脂肪來源干細(xì)胞促進(jìn)血管生成的體外實(shí)驗(yàn)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

3 吳一杰;肝細(xì)胞生長因子基因轉(zhuǎn)染人脂肪干細(xì)胞對(duì)脂肪移植血管化的影響[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

本文編號(hào)：2588489