【摘要】：研究背景我國是肝炎頻發(fā)大國。重組人干擾素是目前國際上公認的有效治療肝炎的藥物,對于基因重組藥物來說,藥品的質量控制是我們關注的焦點,其中藥品的鑒別實驗是藥品定性檢測的主要依據(jù)。對于重組人干擾素來說,根據(jù)《中國藥典》2015版三部,對重組人干擾素α2b制品進行鑒別實驗,主要采用免疫學檢測方法(免疫斑點或免疫印跡)。此方法周期長,成本高,抗體間有批次的差異且全過程需要低溫運輸與保存,不利于快速檢測。本課題篩選出的納米抗體,采用原核表達體系進行生產,降低了生產成本,全過程無需冷鏈運輸,且開發(fā)出了膠體金試紙條,實現(xiàn)了快速檢測。研究方法1、通過免疫動物羊駝,檢測免疫效價達到建庫要求,收集血清中的淋巴細胞,得到cDNA文庫,采用通用引物進行擴增、酶切、連接、電轉化,建立噬菌體文庫。2、針對重組人干擾素α2b進行多輪富集和篩選,得到一株靶向重組人干擾素α2b的納米抗體,將其命名為I_(22),進行了ELISA和Western Blot驗證。3、構建了pET28a-His-I_(22)-His,pET28a-His-I_(22),pET28a-I_(22)-His三株原核表達質粒載體,對其進行表達和純化。4、進行部分理化性質方面的研究如全柱成像毛細管等電點的檢測,N端測序,質譜分子量的測定,同時采用藥典的方法將納米抗體I_(22)、商品化的單克隆抗體、多克隆抗體分別與重組人干擾素α2b標準品進行抗體中和實驗,驗證它們對重組人干擾素α2b制品生物活性的影響。5、將納米抗體I_(22)放置在室溫下保存,對其進行免疫鑒別試驗,并且與商品化的單克隆抗體進行靈敏度檢測比較。建立半定量檢測重組人干擾素α2b的含量的方法,并且將納米抗體I_(22)與膠體金標記,開發(fā)膠體金試紙條進行快速檢測。研究結果1、獲得庫容量為2.6×10~8的抗重組人干擾素α2b納米抗體的基因文庫,經(jīng)過噬菌體救援得到抗重組人干擾素α2b納米抗體噬菌體展示文庫,測滴度為3.1×10~(13)CFU/mL。2、對篩選的陽性克隆,分別進行ELISA和Western Blot實驗對其進行驗證,經(jīng)ELISA驗證總共得到2個陽性克隆,將陽性克隆進行測序,分析結果經(jīng)對比得到相同的序列,將它命名為納米抗體I_(22)。Western Blot驗證陽性克隆的上清與重組人干擾素α2b進行特異性結合。3、將三株構建的菌株pET28a-His-I_(22)-His,pET28a-His-I_(22),pET28a-I_(22)-His都進行了誘導表達,得到了分子量大致相等的蛋白,且都能與重組人干擾素α2b進行結合,沒有明顯的差異。在理化性質檢測與應用實驗中都采用pET28a-His-I22-His表達的目的蛋白進行研究,目的蛋白的產量約為45.7mg/L,純度為100%。4、經(jīng)全柱成像毛細管測得納米抗體的等電點約8.20。N端測序測得氨基酸序列與理論結果一致。質譜測得納米抗體I_(22)分子量為14226.80Da,與理論分子量14226.77Da一致。證明納米抗體I_(22)與商品化的單克隆抗體對重組人干擾素α2b制品的生物活性沒有影響,多克隆抗體對重組人干擾素α2b制品生物活性有影響。5、納米抗體I_(22)應用于Western Blot實驗中,且對重組人干擾素α2b制品有特異性,對重組人干擾素α2b制品中的輔料人血白蛋白沒有結合作用。將納米抗體I_(22)與商品化的單克隆抗體(抗重組人干擾素α2b)進行比較分析,證明納米抗體的檢測限約為31.25ng,同等實驗條件下商品化的單克隆抗體的檢測限約為125ng。納米抗體I_(22)應用于半定量檢測重組人干擾素α2b的含量,精確度高,實驗結果準確。納米抗體I_(22)與膠體金標記技術相結合,檢測重組人干擾素α2b的檢測限可達到1μg/mL。結論本文首次得到了抗重組人干擾素α2b納米抗體的基因序列,構建到原核表達體系大腸桿菌中得到了可溶性表達,對表達的目的蛋白進行Western Blot驗證,證明納米抗體I_(22)比商品化的單克隆抗體更靈敏,且不受溫度的影響,商品化的抗體產量約為25mg/L,納米抗體的產量約為45.7mg/L,經(jīng)鎳柱純化得到純度100%,降低了生產成本。開發(fā)的膠體金試紙條可以實現(xiàn)快速檢測,將原本耗時兩天的免疫鑒別試驗縮短為幾分鐘完成的快速檢測,實現(xiàn)了快速檢測的初步應用。
【圖文】：

圖 1.1 膠體金抑制法結果示圖[14]體的研究進展抗體的發(fā)現(xiàn)年比利時自由大學研究所，在分離沙特阿拉伯駱駝血[15]的抗體清中出現(xiàn)比普通傳統(tǒng)抗體分子量小的蛋白[16]，經(jīng)過還原電泳等的蛋白片段，與普通傳統(tǒng)的抗體有差異[17]（如圖 1.2 所示一步的研究，發(fā)現(xiàn)比普通傳統(tǒng)抗體分子量小的抗體即重鏈抗變區(qū)即我們所說的納米抗體[18]。

圖 1.1 膠體金抑制法結果示圖[14]米抗體的研究進展 納米抗體的發(fā)現(xiàn)1993 年比利時自由大學研究所，在分離沙特阿拉伯駱駝血[15]的抗體過發(fā)現(xiàn)血清中出現(xiàn)比普通傳統(tǒng)抗體分子量小的蛋白[16]，經(jīng)過還原電泳發(fā)子量相等的蛋白片段，與普通傳統(tǒng)的抗體有差異[17]（如圖 1.2 所示）開了進一步的研究，發(fā)現(xiàn)比普通傳統(tǒng)抗體分子量小的抗體即重鏈抗體體的可變區(qū)即我們所說的納米抗體[18]。
【學位授予單位】：中國食品藥品檢定研究院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 李新蘋;賀筍;候鳳;王鋼;曹劍;李延濤;;豬鼻支原體抗血清的制備與鑒定[J];中國畜牧獸醫(yī);2015年09期

2 張國奇;李尤簡;肖紅冉;黃美玲;楊霞;陳創(chuàng)夫;盛金良;;牛病毒性腹瀉病毒納米抗體文庫的構建與鑒定[J];西北農業(yè)學報;2015年03期

3 徐剛;劉實;朱應;;Ⅲ型干擾素最新研究進展[J];中國科學:生命科學;2015年02期

4 馮盼盼;盧雪梅;金小寶;朱家勇;;干擾素的藥理研究進展[J];廣東藥學院學報;2014年06期

5 張留圈;張霄;劉媛;徐重新;張存政;謝雅晶;寇莉萍;劉賢金;;基于磁珠和雙抗夾心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素單鏈抗體篩選與鑒定[J];中國農業(yè)科學;2014年09期

6 李國峰;韓鶴;翟宇;;膠體金技術及其應用[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2013年09期

7 夏雪琴;木亞沙爾·買買提拉洪;翟田甜;李江偉;;抗卵泡刺激素受體納米抗體的制備及鑒定[J];細胞與分子免疫學雜志;2013年08期

8 任志奇;吳英松;劉天才;;新型免疫層析技術的研究進展[J];廣東醫(yī)學;2013年02期

9 高順平;吳國華;張強;;噬菌體展示技術及其在動物病毒學中的應用[J];中國畜牧獸醫(yī);2011年12期

10 甄娜;;加強藥庫管理 保證藥品質量[J];當代醫(yī)學;2011年21期

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2 周鵬;抗LC3納米抗體的篩選與活性鑒定[D];南昌大學;2016年

3 翟田甜;抗CD133納米抗體的制備及細胞毒性肽的活性分析[D];新疆大學;2015年

4 陳錐;一種基于磁珠富集的中藥藥效物質快速發(fā)現(xiàn)方法研究[D];浙江大學;2014年

5 韓迎莉;利用噬菌體展示技術制備全人抗DR5 scFv抗體[D];河南大學;2013年

6 鄭敦武;納米自組裝免疫磁珠制備和干細胞分選技術建立[D];華南理工大學;2012年

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本文編號：2587707