【摘要】：研究背景我國是肝炎頻發(fā)大國。重組人干擾素是目前國際上公認(rèn)的有效治療肝炎的藥物,對于基因重組藥物來說,藥品的質(zhì)量控制是我們關(guān)注的焦點(diǎn),其中藥品的鑒別實(shí)驗(yàn)是藥品定性檢測的主要依據(jù)。對于重組人干擾素來說,根據(jù)《中國藥典》2015版三部,對重組人干擾素α2b制品進(jìn)行鑒別實(shí)驗(yàn),主要采用免疫學(xué)檢測方法(免疫斑點(diǎn)或免疫印跡)。此方法周期長,成本高,抗體間有批次的差異且全過程需要低溫運(yùn)輸與保存,不利于快速檢測。本課題篩選出的納米抗體,采用原核表達(dá)體系進(jìn)行生產(chǎn),降低了生產(chǎn)成本,全過程無需冷鏈運(yùn)輸,且開發(fā)出了膠體金試紙條,實(shí)現(xiàn)了快速檢測。研究方法1、通過免疫動物羊駝,檢測免疫效價達(dá)到建庫要求,收集血清中的淋巴細(xì)胞,得到cDNA文庫,采用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增、酶切、連接、電轉(zhuǎn)化,建立噬菌體文庫。2、針對重組人干擾素α2b進(jìn)行多輪富集和篩選,得到一株靶向重組人干擾素α2b的納米抗體,將其命名為I_(22),進(jìn)行了ELISA和Western Blot驗(yàn)證。3、構(gòu)建了pET28a-His-I_(22)-His,pET28a-His-I_(22),pET28a-I_(22)-His三株原核表達(dá)質(zhì)粒載體,對其進(jìn)行表達(dá)和純化。4、進(jìn)行部分理化性質(zhì)方面的研究如全柱成像毛細(xì)管等電點(diǎn)的檢測,N端測序,質(zhì)譜分子量的測定,同時采用藥典的方法將納米抗體I_(22)、商品化的單克隆抗體、多克隆抗體分別與重組人干擾素α2b標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行抗體中和實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證它們對重組人干擾素α2b制品生物活性的影響。5、將納米抗體I_(22)放置在室溫下保存,對其進(jìn)行免疫鑒別試驗(yàn),并且與商品化的單克隆抗體進(jìn)行靈敏度檢測比較。建立半定量檢測重組人干擾素α2b的含量的方法,并且將納米抗體I_(22)與膠體金標(biāo)記,開發(fā)膠體金試紙條進(jìn)行快速檢測。研究結(jié)果1、獲得庫容量為2.6×10~8的抗重組人干擾素α2b納米抗體的基因文庫,經(jīng)過噬菌體救援得到抗重組人干擾素α2b納米抗體噬菌體展示文庫,測滴度為3.1×10~(13)CFU/mL。2、對篩選的陽性克隆,分別進(jìn)行ELISA和Western Blot實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行驗(yàn)證,經(jīng)ELISA驗(yàn)證總共得到2個陽性克隆,將陽性克隆進(jìn)行測序,分析結(jié)果經(jīng)對比得到相同的序列,將它命名為納米抗體I_(22)。Western Blot驗(yàn)證陽性克隆的上清與重組人干擾素α2b進(jìn)行特異性結(jié)合。3、將三株構(gòu)建的菌株pET28a-His-I_(22)-His,pET28a-His-I_(22),pET28a-I_(22)-His都進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá),得到了分子量大致相等的蛋白,且都能與重組人干擾素α2b進(jìn)行結(jié)合,沒有明顯的差異。在理化性質(zhì)檢測與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)中都采用pET28a-His-I22-His表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行研究,目的蛋白的產(chǎn)量約為45.7mg/L,純度為100%。4、經(jīng)全柱成像毛細(xì)管測得納米抗體的等電點(diǎn)約8.20。N端測序測得氨基酸序列與理論結(jié)果一致。質(zhì)譜測得納米抗體I_(22)分子量為14226.80Da,與理論分子量14226.77Da一致。證明納米抗體I_(22)與商品化的單克隆抗體對重組人干擾素α2b制品的生物活性沒有影響,多克隆抗體對重組人干擾素α2b制品生物活性有影響。5、納米抗體I_(22)應(yīng)用于Western Blot實(shí)驗(yàn)中,且對重組人干擾素α2b制品有特異性,對重組人干擾素α2b制品中的輔料人血白蛋白沒有結(jié)合作用。將納米抗體I_(22)與商品化的單克隆抗體(抗重組人干擾素α2b)進(jìn)行比較分析,證明納米抗體的檢測限約為31.25ng,同等實(shí)驗(yàn)條件下商品化的單克隆抗體的檢測限約為125ng。納米抗體I_(22)應(yīng)用于半定量檢測重組人干擾素α2b的含量,精確度高,實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。納米抗體I_(22)與膠體金標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合,檢測重組人干擾素α2b的檢測限可達(dá)到1μg/mL。結(jié)論本文首次得到了抗重組人干擾素α2b納米抗體的基因序列,構(gòu)建到原核表達(dá)體系大腸桿菌中得到了可溶性表達(dá),對表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證,證明納米抗體I_(22)比商品化的單克隆抗體更靈敏,且不受溫度的影響,商品化的抗體產(chǎn)量約為25mg/L,納米抗體的產(chǎn)量約為45.7mg/L,經(jīng)鎳柱純化得到純度100%,降低了生產(chǎn)成本。開發(fā)的膠體金試紙條可以實(shí)現(xiàn)快速檢測,將原本耗時兩天的免疫鑒別試驗(yàn)縮短為幾分鐘完成的快速檢測,實(shí)現(xiàn)了快速檢測的初步應(yīng)用。
【圖文】：

圖 1.1 膠體金抑制法結(jié)果示圖[14]體的研究進(jìn)展抗體的發(fā)現(xiàn)年比利時自由大學(xué)研究所，在分離沙特阿拉伯駱駝血[15]的抗體清中出現(xiàn)比普通傳統(tǒng)抗體分子量小的蛋白[16]，經(jīng)過還原電泳等的蛋白片段，與普通傳統(tǒng)的抗體有差異[17]（如圖 1.2 所示一步的研究，發(fā)現(xiàn)比普通傳統(tǒng)抗體分子量小的抗體即重鏈抗變區(qū)即我們所說的納米抗體[18]。

圖 1.1 膠體金抑制法結(jié)果示圖[14]米抗體的研究進(jìn)展 納米抗體的發(fā)現(xiàn)1993 年比利時自由大學(xué)研究所，在分離沙特阿拉伯駱駝血[15]的抗體過發(fā)現(xiàn)血清中出現(xiàn)比普通傳統(tǒng)抗體分子量小的蛋白[16]，經(jīng)過還原電泳發(fā)子量相等的蛋白片段，與普通傳統(tǒng)的抗體有差異[17]（如圖 1.2 所示）開了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)比普通傳統(tǒng)抗體分子量小的抗體即重鏈抗體體的可變區(qū)即我們所說的納米抗體[18]。
【學(xué)位授予單位】：中國食品藥品檢定研究院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2587707