本文關(guān)鍵詞：外排泵系統(tǒng)參與幽門螺桿菌適應(yīng)克拉霉素壓力及耐藥過程的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp),是一種單極、多鞭毛的革蘭氏陰性細(xì)菌,寄生在胃粘膜上皮細(xì)胞的表面,很多人在兒童時(shí)期感染了幽門螺桿菌,而且很多人終生攜帶。幽門螺桿菌感染是慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年,世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將幽門螺桿菌列為I級(jí)致癌原。因此,它的根除和感染治療成為人類需要面臨的重大科學(xué)問題。目前,國際上多采用三聯(lián)療法來治療臨床幽門螺桿菌的感染,克拉霉素(clarithromycin,CLR)是新一代的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素因其易吸收,且對(duì)胃酸穩(wěn)定,因此是治療幽門螺桿菌三聯(lián)療法常用的抗生素之一。最新的馬特里共識(shí)(latest Maastricht Consensus)已經(jīng)將以克拉霉素為首的三聯(lián)療法列為根除幽門螺桿菌的首選療法。但是近年來由于克拉霉素的過量和反復(fù)使用,Hp對(duì)CLR的耐藥率國內(nèi)外均呈上升趨勢,目前對(duì)克拉霉素耐藥機(jī)制的研究主要集中在Hp 23 S rRNA基因點(diǎn)突變的分析上。其他與克拉霉素耐藥的機(jī)制在國內(nèi)外未見報(bào)道,但研究中發(fā)現(xiàn),許多Hp耐藥菌株的23S rRNA并未發(fā)生突變,這提示了可能23 S rRNA點(diǎn)突變不是產(chǎn)生耐藥的唯一因素,其耐藥機(jī)制需要進(jìn)一步研究。外排泵系統(tǒng)由一系列膜蛋白組成,根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同,可以將其分為不同的家族。細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制有很多,包括鈍化酶的產(chǎn)生,藥物作用靶點(diǎn)的改變,膜通透性的改變,藥物代謝等。然而,耐藥產(chǎn)生最基本的機(jī)制是外排泵系統(tǒng)將藥物泵出胞外。只有逃過外排泵系統(tǒng)的作用,仍存留在細(xì)菌胞內(nèi)的藥物,才會(huì)引起細(xì)菌其他的耐藥機(jī)制的產(chǎn)生。目前在幽門螺桿菌,已經(jīng)有四種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被確認(rèn),這四種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均屬于RND家族,它們是Hp0605 to Hp0607; HefABC, Hp0971 to Hp0969; HefDEF, Hp1327 to Hp1329;HefGHI and Hp1489 to Hp1487,而且這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已被報(bào)道參與幽門螺桿菌的耐藥。但是,構(gòu)成Hp外排泵系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有很多,己被確認(rèn)參與Hp耐藥調(diào)節(jié)的外排泵系統(tǒng)蛋白只有少數(shù),這些未被報(bào)道的外排泵系統(tǒng)蛋白是否參與幽門螺桿菌對(duì)克拉霉素的耐藥調(diào)節(jié)問題,需要我們進(jìn)行進(jìn)一步的研究。方法1.同源重組法在Hp26695菌株中構(gòu)建Hp0939缺失突變株(△yckJ)2.通過在抗性平板連續(xù)傳代的方法體外誘導(dǎo)Hp26695敏感株產(chǎn)生CLR耐藥。3.微量肉湯稀釋法判定CLR最小抑菌濃度(MIC)。用MH肉湯將CLR做不同濃度稀釋后,再接種幽門螺桿菌,孵育后觀察細(xì)菌生長情況,以抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC。4.基因芯片比較Hp26695野生株在受CLR刺激后及未受CLR刺激時(shí)外排泵系統(tǒng)基因表達(dá)差異。將未經(jīng)CLR刺激的Hp26695野生株以及經(jīng)過CLR刺激后的野生株分別做基因芯片檢測,通過兩組數(shù)據(jù)比較找出CLR壓力下表達(dá)情況變化最大的基因。5.Real-Time PCR法驗(yàn)證基因芯片結(jié)果并對(duì)Hp0939基因的重要性作進(jìn)一步鑒定。將野生株用CLR處理30min后,分別提取處理后及未作處理的RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,運(yùn)用Real-Time PCR檢測基因芯片篩選出的基因的表達(dá)。隨后,我們用不同濃度CLR分別刺激野生株不同時(shí)間,我們又用不同濃度的CLR刺激耐藥株,用同樣的方法提取RNA,反轉(zhuǎn)錄,運(yùn)用Real-Time PCR檢測Hp0939、Hp1017基因的表達(dá)。6.平板菌落計(jì)數(shù)法,MIC測定以及熒光染色法比較Hp26695菌株及△yckJ經(jīng)CLR處理后其生存率以及MIC的變化。結(jié)果1.成功體外誘導(dǎo)出Hp26695敏感株對(duì)CLR的耐藥株。2.CLR能夠引起Hp的嚴(yán)謹(jǐn)應(yīng)答,多種外排泵系統(tǒng)蛋白參與Hp適應(yīng)CLR的壓力過程。將未經(jīng)CLR刺激的Hp26695野生株以及經(jīng)過CLR刺激后的野生株分別做基因芯片檢測結(jié)果比較得出,在CLR刺激下,野生株Hp26695的外排泵系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中,約有47個(gè)基因發(fā)生變化,其中變化較顯著的有24個(gè)(Fold(?)3)3.外排泵系統(tǒng)蛋白Hp0939參與Hp適應(yīng)CLR過程。Real-Time PCR法驗(yàn)證基因芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn),外排泵系統(tǒng)基因Hp0939在Hp26695經(jīng)CLR刺激后,表達(dá)量上調(diào)最顯著(P0.05),超過對(duì)照的100倍。除Hp0939外,Hp1017表達(dá)量上調(diào)僅次于Hp0939,超過對(duì)照50倍。為了初步驗(yàn)證Hp0939的重要性,我們在Hp26695對(duì)CLR的耐藥株中檢測了Hp0939基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Hp0939在耐藥中表達(dá)也是增高的。隨后,我們用1.5MIC of CLR分別刺激野生株10min 20min 30min,并且分別用MIC 1.5MIC 2MIC of CLR刺激野生株30min,我們又用不同濃度的CLR刺激耐藥株,發(fā)現(xiàn)Hp0939的表達(dá)均有不同程度的增高。4.在野生株Hp26695上成功構(gòu)建出Hp0939缺失突變株(△yckJ)5.Hp0939基因的缺失增加Hp對(duì)CLR的敏感性。我們構(gòu)建了Hp0939基因的缺失突變株△yckJ,并通過MIC測定,平板菌落計(jì)數(shù)法,以及熒光染色法比較△yckJ與Hp26695經(jīng)CLR處理后生存率以及MIC的變化。發(fā)現(xiàn),用3MIC的CLR分別處理兩種菌,△yckJ在處理4h后存活率降到1%以下,而Hp26695與前面結(jié)果一致,處理8h后存活率仍在10%以上；熒光染色結(jié)果顯示,3MIC的CLR處理后,△yckJ存活率較野生株明顯降低；同樣,通過對(duì)兩種菌株的MIC檢測發(fā)現(xiàn),△yckJ的MIC較野生株下降了87.5%。6.我們在Hp26695對(duì)CLR的耐藥株中檢測了Hp1017基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Hp1017在耐藥中表達(dá)也是增高的。隨后,我們用1.5MIC of CLR分別刺激野生株10min 20min 30min,并且分別用MIC 1.5MIC 2MIC of CLR刺激野生株30min,我們又用不同濃度的CLR刺激耐藥株,發(fā)現(xiàn)Hp1017的表達(dá)均有不同程度的增高。結(jié)論外排泵系統(tǒng)在Hp適應(yīng)CLR過程中發(fā)揮重要作用,尤其是基因Hp0939(yckJ)的作用最為顯著,使得細(xì)菌抵抗抗生素CLR的損害,最終使得Hp快速適應(yīng)CLR環(huán)境,為進(jìn)一步耐受應(yīng)答,耐藥株產(chǎn)生奠定了時(shí)間基礎(chǔ)和物質(zhì)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：幽門螺桿菌 克拉霉素 外排泵系統(tǒng) yckJ
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378.2
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號(hào)說明13-15
• 前言15-18
• 實(shí)驗(yàn)材料與方法18-35
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-38
• 討論38-42
• 結(jié)論42-43
• 本研究未完成工作43-44
• 附圖表44-57
• 參考文獻(xiàn)57-62
• 致謝62-64
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文64-65
• 附件65

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本文編號(hào)：258490