本文關(guān)鍵詞：UHRF2在生發(fā)中心B細(xì)胞成熟過程中的作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：生發(fā)中心是在外周淋巴器官中為響應(yīng)T細(xì)胞依賴的抗原信號而產(chǎn)生的一種臨時結(jié)構(gòu)。生發(fā)中心中的B細(xì)胞經(jīng)歷了大量的增殖,并篩選出可表達(dá)高親和力抗體的漿細(xì)胞和記憶B細(xì)胞,以防御病原體的再次入侵。而保證該反應(yīng)順利進(jìn)行的機(jī)制也常與B細(xì)胞的癌變密切相關(guān),因此對該階段的調(diào)控尤為關(guān)鍵。UHRF2蛋白可參與調(diào)控細(xì)胞周期、泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)和表觀遺傳系統(tǒng),故被視為調(diào)控多個細(xì)胞信號通路的樞紐。前期報道顯示UHRF2可與多種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、p53、pRB、PCNA、HDAC1、DNMTs、 G9a、甲基化的H3K9以及甲基化的DNA互作,其中UHRF2可對細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白D1和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白E1進(jìn)行泛素化,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期。通過整合不同的信號,UHRF2在協(xié)調(diào)細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)和表觀遺傳學(xué)通路中有重要作用,并且對于細(xì)胞分化起到關(guān)鍵作用。另外,UHRF2在多種癌癥中均出現(xiàn)缺失,也因而被視為一個潛在的抑癌基因。為檢測UHRF2在B細(xì)胞中的作用,我們首先借助流式細(xì)胞儀分選得到人扁桃體各B細(xì)胞亞群,包括初始B細(xì)胞、前生發(fā)中心B細(xì)胞、生發(fā)中心B細(xì)胞和記憶B細(xì)胞,實(shí)時定量PCR和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示UHRF2在生發(fā)中心B細(xì)胞中表達(dá)量最高,進(jìn)入記憶B細(xì)胞階段后下降至接近初始水平,指示UHRF2在生發(fā)中心中可能具有重要作用。之后我們借助cas9技術(shù)構(gòu)建的UHRF2基因敲除小鼠,檢測了其B細(xì)胞發(fā)育的各個亞群,結(jié)果顯示UHRF2基因敲除后小鼠的祖B細(xì)胞、前B細(xì)胞、未成熟B細(xì)胞、過渡期B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞比例均沒有發(fā)生明顯變化,但在派氏結(jié)中的生發(fā)中心B細(xì)胞比例相較于野生型小鼠明顯上升。為證實(shí)該現(xiàn)象,我們通過NP25-CGG免疫小鼠,兩周后檢測小鼠脾臟中生發(fā)中心B細(xì)胞比例的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于野生型小鼠,免疫后UHRF2基因敲除小鼠脾臟內(nèi)的生發(fā)中心B細(xì)胞比例明顯升高,這與未免疫狀態(tài)下小鼠派氏結(jié)中的現(xiàn)象一致。但UHRF2基因缺失并不影響初次免疫及再次免疫后的抗體反應(yīng)。研究表明過表達(dá)UHRF2可以將細(xì)胞阻滯在G1期,于是我們推測UHRF2作為控制細(xì)胞周期進(jìn)行的關(guān)鍵環(huán)節(jié),一旦缺失后生發(fā)中心B細(xì)胞的增殖調(diào)控將出現(xiàn)失控,進(jìn)而導(dǎo)致生發(fā)中心B細(xì)胞比例上升,因此UHRF2的缺失可能是B細(xì)胞淋巴癌患者發(fā)病的一個潛在因素。
【關(guān)鍵詞】：UHRF2 基因敲除 生發(fā)中心 B淋巴細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-33
• 1. 生發(fā)中心反應(yīng)12-23
• 1.1 生發(fā)中心反應(yīng)的起始12-15
• 1.2 生發(fā)中心反應(yīng)的動力學(xué)15-19
• 1.3 生發(fā)中心反應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制19-22
• 1.4 生發(fā)中心反應(yīng)與B細(xì)胞淋巴癌22-23
• 2. UHRF2蛋白的研究進(jìn)展23-33
• 2.1 UHRF2的分子特征23-27
• 2.2 UHRF2在細(xì)胞調(diào)控中有重要作用27-29
• 2.3 UHRF2與疾病29-30
• 2.4 CRISPR-Cas9系統(tǒng)基因敲除技術(shù)構(gòu)建UHRF2敲除小鼠30-31
• 2.5 小結(jié)31-33
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法33-51
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料33-39
• 1.1 臨床樣本及實(shí)驗(yàn)小鼠33
• 1.2 主要試劑33-34
• 1.3 主要儀器設(shè)備和耗材34-35
• 1.4 常用試劑及配制方法35-38
• 1.5 RT-qPCR引物及小鼠鑒定引物序列38-39
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法39-51
• 2.1 扁桃體中B細(xì)胞亞群的分選39-40
• 2.2 提取RNA40-42
• 2.3 細(xì)胞裂解42-43
• 2.4 蛋白定量43-44
• 2.5 SDS-PAGE凝膠電泳44-45
• 2.6 Western Blot45-46
• 2.7 小鼠基因型的鑒定46-47
• 2.8 初次免疫小鼠47
• 2.9 免疫后取材47-48
• 2.10 脾臟中生發(fā)中心B細(xì)胞的檢測48
• 2.11 脾臟中生發(fā)中心B細(xì)胞的流式分析48
• 2.12 ELISA48-49
• 2.13 再次免疫小鼠49-51
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析51-61
• 1. UHRF2在人扁桃體中各B細(xì)胞亞群的表達(dá)情況51-52
• 2. 小鼠基因型鑒定和UHRF2蛋白水平表達(dá)檢測結(jié)果52-53
• 3. 骨髓中B細(xì)胞各亞群的檢測結(jié)果53-54
• 4. 小鼠脾重/體重和脾臟中單個核細(xì)胞數(shù)量的檢測54-55
• 5. 脾臟中B細(xì)胞亞群的檢測55
• 6. 派氏結(jié)中B細(xì)胞亞群的檢測55-56
• 7. 初次免疫后UHRF2基因敲除型小鼠脾臟生發(fā)中心B細(xì)胞比例上升56-57
• 8. 初次免疫不影響UHRF2敲除型小鼠脾臟生發(fā)中心Tfh細(xì)胞比例57-58
• 9. UHRF2敲除對初次免疫后小鼠抗體分泌的影響58
• 10. UHRF2敲除對再次免疫后小鼠抗體分泌的影響58-60
• 小結(jié)60-61
• 第四章 總結(jié)與討論61-64
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 致謝70

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2 歐陽斌q

本文編號：258000