【摘要】：背景 敗血癥是最常見(jiàn)的感染性疾病之一，也是住院病人中死亡的主要原因之一。嚴(yán)重的敗血癥占進(jìn)入重癥監(jiān)護(hù)室（ICU）治療的病人中的1/5，也是非心臟病ICU中病人的一個(gè)主要的死亡原因。在美國(guó)，嚴(yán)重?cái)⊙Y的死亡率為28.6%，相當(dāng)于每年有21.5萬(wàn)人死于該疾病。敗血癥除了造成心肝腎等器官的衰竭外，還能夠引起骨骼肌的嚴(yán)重和持續(xù)性改變。感染性休克時(shí)，呼吸肌明顯受損，感染性休克的動(dòng)物模型顯示，呼吸肌收縮功能下降可以造成高碳酸血癥性通氣衰竭和呼吸驟停。引起衰竭的原因很多，其中包括細(xì)菌內(nèi)毒素，炎癥因子，前列腺素，血小板激活因子，反應(yīng)氧和一氧化氮，它們之間相互影響。2003年，研究人員在一次對(duì)需要機(jī)械通氣的危重病人的膈肌功能進(jìn)行客觀評(píng)估的過(guò)程中意外地發(fā)現(xiàn)，這些病人的膈肌極度無(wú)力，肌力僅有健康常人肌力的20-25%。ICU病人如何導(dǎo)致極度呼吸肌無(wú)力的準(zhǔn)確機(jī)制很不清楚，但是許多病人都存在有感染。至少一些病人的肌無(wú)力被認(rèn)為繼發(fā)于細(xì)胞因子的作用。研究發(fā)現(xiàn)全身感染炎癥是繼發(fā)膈肌肌無(wú)力的最重要的原因之一，但其機(jī)制也不清楚，相關(guān)研究也鮮有報(bào)導(dǎo)。本研究將尋找感染狀態(tài)下(如胸腹部感染，敗血癥和感染性休克等)膈肌無(wú)力的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，特別是JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以及其中涉及的靶基因和相應(yīng)的靶蛋白，運(yùn)用該基因和蛋白質(zhì)的有效抑制劑(包括基因抑制和蛋白質(zhì)抑制劑)，阻止感染狀態(tài)下膈肌蛋白質(zhì)的分解，提高膈肌的收縮功能，促進(jìn)肌力的快速有效恢復(fù)。大量實(shí)驗(yàn)表明JNK信號(hào)通路在細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)以及多種人類疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，因此JNK信號(hào)通路是正常與疾病狀態(tài)時(shí)細(xì)胞的一個(gè)重要調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。研究表明，感染造成的膈肌無(wú)力的主要信號(hào)通路是p38、JNK1和PKR，而JNK信號(hào)通路在多種人類疾病如：敗血癥、COPD、心力衰竭、尿毒癥、腫瘤等的發(fā)生與發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。 我們選取的靶基因是TIPE2和PCNP。TNF-α-induced protein8-like2（TIPE2）是腫瘤壞死因子(TNF)α誘導(dǎo)蛋白8(TNFAIP8，一個(gè)可調(diào)節(jié)凋亡的DED蛋白)家族成員之一，是與細(xì)胞死亡和炎癥有關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，是一個(gè)對(duì)保持適應(yīng)性免疫和先天免疫的穩(wěn)態(tài)非常重要的蛋白因子。TIPE2優(yōu)先表達(dá)于淋巴組織，肌肉組織也有少量表達(dá)。在小鼠體內(nèi)，它的缺失可以導(dǎo)致多器官炎癥、脾腫大、過(guò)早死亡。TIPE2缺陷的動(dòng)物對(duì)于感染性休克異常敏感，TIPE2缺陷的細(xì)胞對(duì)于TLR和TCR的活化具有高應(yīng)答性。更為重要的是，TIPE2與casepase8結(jié)合后，抑制蛋白-1和核因子-κB的活化，促進(jìn)Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。對(duì)casepase8的抑制，顯著的限制了TIPE2缺陷細(xì)胞的高應(yīng)答性。 PEST-containing nuclear protein (PCNP)是一種與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的核蛋白，主要存在于細(xì)胞核內(nèi)。這種新型的指環(huán)狀蛋白是一種具有泛素化能力的蛋白連接酶，同時(shí)它可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)利用內(nèi)毒素作用于小鼠骨骼肌細(xì)胞C2C12細(xì)胞，制備肌細(xì)胞感染模型，同時(shí)使用JNK1抑制劑JNK1-DN（JNK1-DN，即JNK1dominant negative，具有顯性負(fù)效應(yīng)。機(jī)理是突變型蛋白和相關(guān)蛋白形成無(wú)功能的二聚體，野生型蛋白功能被抑制。JNK1-DN不具有正常基因產(chǎn)物的功能，反而通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制，可以抑制正�；虍a(chǎn)物的功能。），阻斷JNK通路，研究發(fā)現(xiàn)JNK1抑制劑明顯抑制caspase3和caspase8的激活，同時(shí)發(fā)現(xiàn)JNK1與TIPE2及核蛋白PCNP有一定的相互關(guān)系。 目前,以JNK信號(hào)通路中活化的關(guān)鍵分子為靶點(diǎn)的膈肌無(wú)力治療研究正在深入。在感染狀態(tài)下膈肌無(wú)力的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，特別是JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，探討膈肌無(wú)力的分子生物學(xué)機(jī)制以及其中涉及的靶基因和靶蛋白是我們研究的重點(diǎn)。 目的 通過(guò)制備肌細(xì)胞感染模型，研究JNK1信號(hào)通路中肌細(xì)胞發(fā)生凋亡的分子機(jī)制及其涉及的靶基因和靶蛋白。 方法 應(yīng)用內(nèi)毒素作用C2C12細(xì)胞，制備肌細(xì)胞感染模型，使用JNK1基因抑制劑，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖的影響；RT-PCR、半定量PCR檢測(cè)對(duì)PCNP和TIPE2基因表達(dá)的影響；通過(guò)WB分析激活的JNK1、caspase3和caspase8，以及對(duì)C2C12細(xì)胞表面標(biāo)志肌球蛋白(myosin)的影響；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞周期及凋亡的影響。同時(shí)構(gòu)建了PCNP和TIPE2過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒，測(cè)序正確后，穩(wěn)轉(zhuǎn)C2C12細(xì)胞，進(jìn)行真核表達(dá)，并成功表達(dá)相應(yīng)蛋白。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖的影響；利用WB實(shí)驗(yàn)研究JNK1、PCNP、TIPE2三者間蛋白表達(dá)的相互關(guān)系。 結(jié)果 1.成功構(gòu)建了PCNP和TIPE2真核表達(dá)質(zhì)粒，并在小鼠骨骼肌細(xì)胞系C2C12細(xì)胞中成功表達(dá)出蛋白。 2. LPS刺激C2C12細(xì)胞（肌細(xì)胞感染模型），可以激活JNK1通路，上調(diào)caspase3、8。JNK1基因抑制劑（JNK1-DN）顯著阻斷JNK1的激活，同時(shí)抑制了caspase3、8的活化。 3. JNK1抑制劑（JNK1-DN），顯著上調(diào)C2C12細(xì)胞表面標(biāo)志肌球蛋白(myosin)；JNK1抑制劑及PCNP都促進(jìn)了C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)。 4. TIPE2過(guò)表達(dá)上調(diào)了JNK1，而PCNP過(guò)表達(dá)可以下調(diào)JNK1。 5. LPS刺激C2C12細(xì)胞后，C2C12細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象。 結(jié)論 成功構(gòu)建了PCNP和TIPE2真核表達(dá)質(zhì)粒和肌細(xì)胞感染模型，JNK1在肌細(xì)胞感染模型中有重要的調(diào)控作用；JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)的信號(hào)分子PCNP和TIPE2對(duì)細(xì)胞功能有影響。這些結(jié)果為提高膈肌收縮能力，改善炎癥等情況造成的膈肌收縮乏力，促進(jìn)呼吸功能改善的研究奠定基礎(chǔ)。為需要呼吸肌輔助呼吸的危重病人造福。
【圖文】：

使菌液充分裂解，加入350 μl溶液Ⅲ立即輕慢顛倒6-8次，12000 rpm上清小心轉(zhuǎn)至吸附柱CP3內(nèi)（平衡），，12000 g、離心1 min，棄去廢液 μl，12000 rpm、離心1 min，棄去廢液，此步驟重復(fù)兩次。然后空離pm。將吸附柱移至干凈的EP管內(nèi)，室溫靜置5 min，往吸附柱膜中央滴脫液，室溫放置2 min，12000 rpm、離心2 min，收集到的洗脫液即為質(zhì)糖凝膠電泳和質(zhì)粒酶切鑒定，篩選出的陽(yáng)性克隆送 Invitrogen 公司測(cè)序 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 PCNP 和 TIPE2 全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增NP和TIPE2全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖1-1、1-2所示。圖1-1是PCR擴(kuò)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為554 bp。圖1-2是PCR擴(kuò)增TIPE2全長(zhǎng)基因，擴(kuò)增產(chǎn)物

使菌液充分裂解，加入350 μl溶液Ⅲ立即輕慢顛倒6-8次，12000 rpm上清小心轉(zhuǎn)至吸附柱CP3內(nèi)（平衡），12000 g、離心1 min，棄去廢液 μl，12000 rpm、離心1 min，棄去廢液，此步驟重復(fù)兩次。然后空離pm。將吸附柱移至干凈的EP管內(nèi)，室溫靜置5 min，往吸附柱膜中央滴脫液，室溫放置2 min，12000 rpm、離心2 min，收集到的洗脫液即為質(zhì)糖凝膠電泳和質(zhì)粒酶切鑒定，篩選出的陽(yáng)性克隆送 Invitrogen 公司測(cè)序 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 PCNP 和 TIPE2 全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增NP和TIPE2全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖1-1、1-2所示。圖1-1是PCR擴(kuò)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為554 bp。圖1-2是PCR擴(kuò)增TIPE2全長(zhǎng)基因，擴(kuò)增產(chǎn)物
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 賈紅軒,熊盛道,徐永健;膈肌疲勞研究進(jìn)展[J];實(shí)用臨床醫(yī)學(xué);2002年03期

本文編號(hào)：2581540