【摘要】：背景 敗血癥是最常見的感染性疾病之一，也是住院病人中死亡的主要原因之一。嚴重的敗血癥占進入重癥監(jiān)護室（ICU）治療的病人中的1/5，也是非心臟病ICU中病人的一個主要的死亡原因。在美國，嚴重敗血癥的死亡率為28.6%，相當于每年有21.5萬人死于該疾病。敗血癥除了造成心肝腎等器官的衰竭外，還能夠引起骨骼肌的嚴重和持續(xù)性改變。感染性休克時，呼吸肌明顯受損，感染性休克的動物模型顯示，呼吸肌收縮功能下降可以造成高碳酸血癥性通氣衰竭和呼吸驟停。引起衰竭的原因很多，其中包括細菌內(nèi)毒素，炎癥因子，前列腺素，血小板激活因子，反應(yīng)氧和一氧化氮，它們之間相互影響。2003年，研究人員在一次對需要機械通氣的危重病人的膈肌功能進行客觀評估的過程中意外地發(fā)現(xiàn)，這些病人的膈肌極度無力，肌力僅有健康常人肌力的20-25%。ICU病人如何導致極度呼吸肌無力的準確機制很不清楚，但是許多病人都存在有感染。至少一些病人的肌無力被認為繼發(fā)于細胞因子的作用。研究發(fā)現(xiàn)全身感染炎癥是繼發(fā)膈肌肌無力的最重要的原因之一，但其機制也不清楚，相關(guān)研究也鮮有報導。本研究將尋找感染狀態(tài)下(如胸腹部感染，敗血癥和感染性休克等)膈肌無力的主要信號轉(zhuǎn)導通路，特別是JNK信號轉(zhuǎn)導通路，以及其中涉及的靶基因和相應(yīng)的靶蛋白，運用該基因和蛋白質(zhì)的有效抑制劑(包括基因抑制和蛋白質(zhì)抑制劑)，阻止感染狀態(tài)下膈肌蛋白質(zhì)的分解，提高膈肌的收縮功能，促進肌力的快速有效恢復。大量實驗表明JNK信號通路在細胞分化、細胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)以及多種人類疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，因此JNK信號通路是正常與疾病狀態(tài)時細胞的一個重要調(diào)節(jié)靶點。研究表明，感染造成的膈肌無力的主要信號通路是p38、JNK1和PKR，而JNK信號通路在多種人類疾病如：敗血癥、COPD、心力衰竭、尿毒癥、腫瘤等的發(fā)生與發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。 我們選取的靶基因是TIPE2和PCNP。TNF-α-induced protein8-like2（TIPE2）是腫瘤壞死因子(TNF)α誘導蛋白8(TNFAIP8，一個可調(diào)節(jié)凋亡的DED蛋白)家族成員之一，是與細胞死亡和炎癥有關(guān)的關(guān)鍵信號傳導蛋白，是一個對保持適應(yīng)性免疫和先天免疫的穩(wěn)態(tài)非常重要的蛋白因子。TIPE2優(yōu)先表達于淋巴組織，肌肉組織也有少量表達。在小鼠體內(nèi)，它的缺失可以導致多器官炎癥、脾腫大、過早死亡。TIPE2缺陷的動物對于感染性休克異常敏感，TIPE2缺陷的細胞對于TLR和TCR的活化具有高應(yīng)答性。更為重要的是，TIPE2與casepase8結(jié)合后，抑制蛋白-1和核因子-κB的活化，促進Fas誘導的細胞凋亡。對casepase8的抑制，顯著的限制了TIPE2缺陷細胞的高應(yīng)答性。 PEST-containing nuclear protein (PCNP)是一種與細胞周期調(diào)控有關(guān)的核蛋白，主要存在于細胞核內(nèi)。這種新型的指環(huán)狀蛋白是一種具有泛素化能力的蛋白連接酶，同時它可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。 本實驗利用內(nèi)毒素作用于小鼠骨骼肌細胞C2C12細胞，制備肌細胞感染模型，同時使用JNK1抑制劑JNK1-DN（JNK1-DN，即JNK1dominant negative，具有顯性負效應(yīng)。機理是突變型蛋白和相關(guān)蛋白形成無功能的二聚體，野生型蛋白功能被抑制。JNK1-DN不具有正�；虍a(chǎn)物的功能，反而通過競爭性抑制，可以抑制正常基因產(chǎn)物的功能。），阻斷JNK通路，研究發(fā)現(xiàn)JNK1抑制劑明顯抑制caspase3和caspase8的激活，同時發(fā)現(xiàn)JNK1與TIPE2及核蛋白PCNP有一定的相互關(guān)系。 目前,以JNK信號通路中活化的關(guān)鍵分子為靶點的膈肌無力治療研究正在深入。在感染狀態(tài)下膈肌無力的主要信號轉(zhuǎn)導通路，特別是JNK信號轉(zhuǎn)導通路，探討膈肌無力的分子生物學機制以及其中涉及的靶基因和靶蛋白是我們研究的重點。 目的 通過制備肌細胞感染模型，研究JNK1信號通路中肌細胞發(fā)生凋亡的分子機制及其涉及的靶基因和靶蛋白。 方法 應(yīng)用內(nèi)毒素作用C2C12細胞，制備肌細胞感染模型，使用JNK1基因抑制劑，通過MTT實驗方法檢測對細胞增殖的影響；RT-PCR、半定量PCR檢測對PCNP和TIPE2基因表達的影響；通過WB分析激活的JNK1、caspase3和caspase8，以及對C2C12細胞表面標志肌球蛋白(myosin)的影響；利用流式細胞術(shù)檢測對細胞周期及凋亡的影響。同時構(gòu)建了PCNP和TIPE2過表達重組質(zhì)粒，測序正確后，穩(wěn)轉(zhuǎn)C2C12細胞，進行真核表達，并成功表達相應(yīng)蛋白。通過MTT實驗檢測對細胞增殖的影響；利用WB實驗研究JNK1、PCNP、TIPE2三者間蛋白表達的相互關(guān)系。 結(jié)果 1.成功構(gòu)建了PCNP和TIPE2真核表達質(zhì)粒，并在小鼠骨骼肌細胞系C2C12細胞中成功表達出蛋白。 2. LPS刺激C2C12細胞（肌細胞感染模型），可以激活JNK1通路，上調(diào)caspase3、8。JNK1基因抑制劑（JNK1-DN）顯著阻斷JNK1的激活，同時抑制了caspase3、8的活化。 3. JNK1抑制劑（JNK1-DN），顯著上調(diào)C2C12細胞表面標志肌球蛋白(myosin)；JNK1抑制劑及PCNP都促進了C2C12細胞生長。 4. TIPE2過表達上調(diào)了JNK1，而PCNP過表達可以下調(diào)JNK1。 5. LPS刺激C2C12細胞后，C2C12細胞沒有發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象。 結(jié)論 成功構(gòu)建了PCNP和TIPE2真核表達質(zhì)粒和肌細胞感染模型，JNK1在肌細胞感染模型中有重要的調(diào)控作用；JNK信號轉(zhuǎn)導通路中相關(guān)的信號分子PCNP和TIPE2對細胞功能有影響。這些結(jié)果為提高膈肌收縮能力，改善炎癥等情況造成的膈肌收縮乏力，促進呼吸功能改善的研究奠定基礎(chǔ)。為需要呼吸肌輔助呼吸的危重病人造福。
【圖文】：

使菌液充分裂解，加入350 μl溶液Ⅲ立即輕慢顛倒6-8次，12000 rpm上清小心轉(zhuǎn)至吸附柱CP3內(nèi)（平衡），，12000 g、離心1 min，棄去廢液 μl，12000 rpm、離心1 min，棄去廢液，此步驟重復兩次。然后空離pm。將吸附柱移至干凈的EP管內(nèi)，室溫靜置5 min，往吸附柱膜中央滴脫液，室溫放置2 min，12000 rpm、離心2 min，收集到的洗脫液即為質(zhì)糖凝膠電泳和質(zhì)粒酶切鑒定，篩選出的陽性克隆送 Invitrogen 公司測序 實驗結(jié)果 PCNP 和 TIPE2 全長基因的擴增NP和TIPE2全長基因的擴增，電泳結(jié)果如圖1-1、1-2所示。圖1-1是PCR擴，擴增產(chǎn)物大小為554 bp。圖1-2是PCR擴增TIPE2全長基因，擴增產(chǎn)物

使菌液充分裂解，加入350 μl溶液Ⅲ立即輕慢顛倒6-8次，12000 rpm上清小心轉(zhuǎn)至吸附柱CP3內(nèi)（平衡），12000 g、離心1 min，棄去廢液 μl，12000 rpm、離心1 min，棄去廢液，此步驟重復兩次。然后空離pm。將吸附柱移至干凈的EP管內(nèi)，室溫靜置5 min，往吸附柱膜中央滴脫液，室溫放置2 min，12000 rpm、離心2 min，收集到的洗脫液即為質(zhì)糖凝膠電泳和質(zhì)粒酶切鑒定，篩選出的陽性克隆送 Invitrogen 公司測序 實驗結(jié)果 PCNP 和 TIPE2 全長基因的擴增NP和TIPE2全長基因的擴增，電泳結(jié)果如圖1-1、1-2所示。圖1-1是PCR擴，擴增產(chǎn)物大小為554 bp。圖1-2是PCR擴增TIPE2全長基因，擴增產(chǎn)物
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 賈紅軒,熊盛道,徐永健;膈肌疲勞研究進展[J];實用臨床醫(yī)學;2002年03期

本文編號：2581540