【摘要】：目的探討核仁素(nucleolin)對原代神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)分化的影響及其相關(guān)機(jī)制。方法構(gòu)建核仁素siRNA腺病毒表達(dá)載體,將經(jīng)鑒定正確的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞,包裝得到具有感染能力的nucleolin-siRNA重組腺病毒。病毒體外感染原代NSCs,采用Western blot檢測nucleolin蛋白的表達(dá)情況,Nucleolin-siRNA對神經(jīng)干細(xì)胞Nestin、Wnt3、β-catenin蛋白表達(dá)的影響;采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測nucleolin-siRNA對神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響。結(jié)果經(jīng)酶切和測序鑒定均證實(shí)nucleolinsiRNA重組腺病毒載體構(gòu)建成功,其插入序列正確無誤。Western blot檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染nucleolin-siRNA2的細(xì)胞nucleolin表達(dá)明顯受到抑制。siRNA+組NSCs分化為NSE陽性細(xì)胞和GFAP陽性細(xì)胞的分化率明顯比CON組、siRNA-組增加,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。與陰性對照組相比,siRNA+組Nestin的表達(dá)明顯減少,Wnt3表達(dá)明顯增多,β-catenin入核明顯增多,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論本研究成功地構(gòu)建了針對nucleolin基因的siRNA重組腺病毒載體,沉默nucleolin可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的分化,其機(jī)制可能與Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān)。
【圖文】：

培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞團(tuán)逐漸增大、增多，7d時(shí)生長為數(shù)十個(gè)至數(shù)百個(gè)細(xì)胞的克隆，呈球形懸浮生長，形態(tài)不規(guī)則，折光性強(qiáng)，周圍可見混雜的其他細(xì)胞（圖1A）。原代克隆的形成率在20%~30%之間。傳代后出現(xiàn)與原代培養(yǎng)相同的大量次代克隆，并逐漸增大，7d后可再次傳代。連續(xù)傳代3次后，可見細(xì)胞團(tuán)仍呈懸浮生長，形態(tài)規(guī)則，折光性強(qiáng)，無突起生長，周圍無明顯混雜細(xì)胞（圖1B）。NSCs在體外傳代培養(yǎng)后，已分化成熟的細(xì)胞會(huì)逐漸貼壁死亡，而NSCs則在培養(yǎng)基中懸浮生長，因此利用傳代培養(yǎng)的方法可以純化所培養(yǎng)的NSCs。ABCDEF圖1SD大鼠NSCs的體外培養(yǎng)與鑒定Fig.1Invitrocultureandidentificationofneuralstemcells(NSCs)fromSDrats(Originalmagnification:×100).A,B:ThefirstandfourthpassagesofneonatalratNSCs,respectively;C:DifferentiatedNSCs;D:Nestin-positiveNSCslabeledwithCY3(red);E:NSE-positiveNSCsdoublelabeledwithCY3(red)andHoechst33258(blue);F:GFAP-positiveNSCsdoublelabeledwithFITC(green)andHoechst33258(blue).2.2NSCs的誘導(dǎo)分化及鑒定將NSCs接種至已用明膠或多聚賴氨酸包被的六孔板中，一部分仍然用含20μL/mLB27，10ng/mLbFGF，20ng/mLEGF的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)2h后，行nestin免疫熒光染色；另一部分加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，，絕大多數(shù)細(xì)胞在24h內(nèi)會(huì)貼壁，并從細(xì)胞團(tuán)的邊緣伸出突起（圖1C）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，越來越多的細(xì)胞從細(xì)胞團(tuán)中爬行出來，伸出長長的突起，有時(shí)會(huì)交織成網(wǎng)。免疫細(xì)胞化學(xué)發(fā)現(xiàn)：NSCs標(biāo)記蛋白nestin在各級克隆中都有表達(dá)（圖1D）；在用10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基誘導(dǎo)7d后，可見神經(jīng)元細(xì)胞的標(biāo)記物NSE（圖1E）和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物GFAP（圖1F）在誘導(dǎo)7d的細(xì)胞中表?

后出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE），表現(xiàn)為貼壁細(xì)胞變圓，腫脹，并逐漸從壁上脫落下來；轉(zhuǎn)染10~12d后可見圓形細(xì)胞呈葡萄串狀從集分布于正常的HEK293A細(xì)胞上，并出現(xiàn)病毒空斑。由于腺病毒載體攜帶了GFP報(bào)告基因，可用熒光顯微鏡觀察。收集包裝成功的病毒裂解液，轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK293A細(xì)胞可觀察到同樣的結(jié)果（圖3）。圖2測序鑒定3個(gè)nucleolin-siRNA表達(dá)載體的插入序列Fig.2Sequencingresultsoftheinsertsof3differentnucleolinsiRNA.A:shRNAl;B:shRNA2;C:shRNA3.ABC圖3重組腺病毒感染HEK293A細(xì)胞Fig.3Nucleolin-siRNArecombinantadenovirustransducedinHEK293Acells(×100).A,C,E,G:HEK293AcellsinfectedbysiRNA-ornucleolin-siRNA1-3recombinantadenovirus(invertcontrastmicroscopy,×100);B,D,F,H:HEK293AcellsinfectedbysiRNA-ornucleolin-siRNA1-3recombinantadenovirus(fluorescencemicroscopy,×100).Nucleoli-siRNA-Nucleoli-siRNA1Nucleoli-siRNA2Nucleoli-siRNA3ABCDEFGH·878·JSouthMedUniv,2017,37(7):875-882http://www.j-smu.com

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本文編號：2580990