發(fā)布時(shí)間：2020-02-18 14:58

【摘要】：[目的] 腦卒中是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病,其致殘率和病死率均很高。腦卒中治療的關(guān)鍵是重建神經(jīng)通路,重建神經(jīng)通路的前提是有新生神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)生。成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn),給腦卒中的治療帶來了新的曙光。但神經(jīng)干細(xì)胞的組織來源一直是這一研究領(lǐng)域最棘手的問題。 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cell, BMSC),是存在于骨髓基質(zhì)中一種成體干細(xì)胞,來源于中胚層,具有很強(qiáng)的自我增殖和多向分化能力,可以分化為多種不同的組織細(xì)胞,是組織工程學(xué)研究中的一種理想種子細(xì)胞。目前國內(nèi)外研究報(bào)道骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)外可被誘導(dǎo)分化神經(jīng)細(xì)胞,如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可以被化學(xué)物質(zhì)如視黃酸、β-巰基乙醇,中藥如黃芩甙、天麻等誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞。但是利用轉(zhuǎn)錄因子Brn2、Asc11、Mytll基因?qū)撬杌|(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究在國內(nèi)尚屬空白。 Brn2又稱為POU3F2,是POU轉(zhuǎn)錄因子家族之一,主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)當(dāng)中表達(dá)。有研究表明,Brn2可調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的基因表達(dá),在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)發(fā)生方面發(fā)揮著重要的作用。Ascl1基因的編碼產(chǎn)物是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(BHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族之一。Ascll在神經(jīng)定型、分化,以及嗅覺與自主神經(jīng)元的發(fā)生方面發(fā)揮著重要的作用。Mytll基因又稱為Nzfl基因,可特異性結(jié)合于視黃酸反應(yīng)原件,表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活化作用。Mytll基因可能與神經(jīng)系統(tǒng)與腦垂體的基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)。 因此,本研究擬通過克隆并構(gòu)建一個(gè)含有Brn2、Asc11、Mytll基因的慢病毒表達(dá)載體,初步探討轉(zhuǎn)染Asc11、Mytll基因的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體外分化為神經(jīng)細(xì)胞的情況,為下一步進(jìn)行骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)移植或基因治療打下基礎(chǔ)。 l方法] 1.用Percol1淋巴細(xì)胞分離液分離出大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,并用含20%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),胰酶消化傳代,擴(kuò)增大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。 2.采用PCR技術(shù)克隆出長分別為696 bp、1338bp及3558bp的Brn2.Ascl1、Mytll基因部分序列,利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建pLV.EX3d.null-CMVmAscl1/E2A/mBrn2/F2A/mMytl1質(zhì)粒。經(jīng)酶切、PCR.DNA序列分析鑒定確定載體構(gòu)建無誤。 3.取第四代、第六代BMSC,用慢病毒轉(zhuǎn)染法介導(dǎo)Brn2、Ascll、Mytl1基因進(jìn)入到骨髓基質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)。觀察細(xì)胞形態(tài)的改變。 [結(jié)果] 1.大鼠BMSC的分離培養(yǎng)用Percol1淋巴細(xì)胞分離液對大鼠骨髓作密度梯度離心,所得細(xì)胞為比較均一的球形單個(gè)核細(xì)胞,臺(tái)盼蘭染色細(xì)胞活力達(dá)99%。接種培養(yǎng)10-14天后,細(xì)胞貼滿培養(yǎng)瓶瓶底,進(jìn)行細(xì)胞的首次傳代。傳3-4代后,可以形成較典型的BMSC,細(xì)胞大而扁,呈梭形、三角形、多角形,折光性差,立體感不強(qiáng)。 2. Brn2、Ascll、Mytl1基因片段經(jīng)測序鑒定,克隆基因序列與GenBank收錄小鼠Brn2(NC_000070.5)、Ascll(NC_000076.5)、Mytll(NC 000078.5)完全同源。并以此成功構(gòu)建Brn2、Ascll、Myt11基因的真核表達(dá)載體pLV.EX3d.ni11-CMVmAscl1/E2A/mBrn2/F2A/ mMytl1. 3.BMSC轉(zhuǎn)染帶有Brn2.Ascl1.Mytl1基因的表達(dá)載體后,可以觀察到胞體收縮,折光性增強(qiáng),并伸出較長軸突和樹突樣突起,形態(tài)類似神經(jīng)細(xì)胞。 [結(jié)論]轉(zhuǎn)染的Brn2.Ascl1.Mytl1基因的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體外可以分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 戴宜武 ,徐如祥 ,姜曉丹 ,鄒雨汐 ,劉智良 ,杜謀選 ,蔡穎謙;體外誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞和成熟神經(jīng)細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2002年08期

2 楊萍,宋林,李振強(qiáng);bFGF對大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用[J];局解手術(shù)學(xué)雜志;2004年03期

3 莊　菁 ,余克明 ,葛 堅(jiān) ,楊智寬 ,喻　瓴 ,郭 彥 ,王智崇;神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)成年鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的研究[J];眼科研究;2002年02期

4 汪泱,鄧志鋒,賴賢良,王共先,李明,宋書欣;阿魏酸鈉誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的初步研究[J];中草藥;2004年03期

5 賈延R，

本文編號：2580742