【摘要】：第一部分隨機(jī)寡核苷酸文庫的構(gòu)建及PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 目的成功構(gòu)建隨機(jī)寡核苷酸文庫,并對對稱及不對稱PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,獲得最優(yōu)的PCR反應(yīng)條件。 方法設(shè)計一個兩端為固定序列：5’端為23個堿基固定序列,3’端為20個堿基固定序列,中間為35個堿基隨機(jī)序列的共78個堿基的隨機(jī)寡核苷酸文庫及相應(yīng)的引物,送生物公司合成。取文庫及引物直接經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。根據(jù)引物Tm值,設(shè)置12個退火溫度梯度(53.3—65.3℃)、循環(huán)次數(shù)(5、8、12、16、20、24)及引物比(P1：P2=30：1、50：1、80：1及100：1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別對對稱、直接及間接不對稱PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。 結(jié)果78bp的ssDNA經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳后,條帶在40-50bp的1Obp dsDNA ladder處。經(jīng)PCR擴(kuò)增為78bp的dsDNA的電泳條帶則在80bp的lObp dsDNA ladder附近。對稱PCR反應(yīng)條件的最優(yōu)的退火溫度為60℃,最優(yōu)的循環(huán)次數(shù)為24次。間接不對稱PCR循環(huán)次數(shù)為40,最優(yōu)的引物比為P1：P2=100：1。直接不對稱PCR未能獲得目的產(chǎn)物。 結(jié)論成功構(gòu)建了隨機(jī)寡核苷酸文庫及相應(yīng)的引物。對稱PCR及間接不對稱PCR反應(yīng)條件優(yōu)化成功,在優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件下,能獲得特異性高、量大的PCR產(chǎn)物。直接不對稱PCR反應(yīng)條件優(yōu)化失敗,但對后續(xù)實驗沒有影響。 第二部分用SELEX技術(shù)篩選Ras蛋白ssDNA適配子 目的用SELEX技術(shù)篩選Ras蛋白的高特異性及親和力ssDNA適配子。 方法把靶物質(zhì)Ras蛋白用包被液包被于篩選介質(zhì)96孔酶聯(lián)板上,加入ssDNA文庫,在SELEX結(jié)合緩沖液內(nèi)結(jié)合、用SELEX沖洗液沖洗、用SELEX洗脫液洗脫,最后用DNA回收試劑盒回收結(jié)合ssDNA。再以結(jié)合ssDNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增,并運(yùn)用間接不對稱PCR及鏈酶親和素磁珠技術(shù)分離獲得大量的ssDNA亞文庫,以此作為下一輪篩選文庫,重復(fù)上述步驟進(jìn)行反復(fù)篩選,直至結(jié)合率達(dá)到峰值,篩選結(jié)束。每一輪適配子及其PCR產(chǎn)物均經(jīng)3%的瓊脂糖凝膠鑒定結(jié)果。計算每輪ssDNA適配子與Ras蛋白結(jié)合率,用ELISA法檢測每輪ssDNA適配子與Ras蛋白親和力。 結(jié)果間接不對稱PCR和鏈酶親和素磁珠技術(shù)均分離獲得大量的ssDNA。每一輪適配子及其PCR產(chǎn)物經(jīng)3%的瓊脂糖凝膠鑒定,均出現(xiàn)在預(yù)期的目的條帶。第一輪適配子與Ras蛋白結(jié)合率最低,為2.3%；親和力OD值最低,為0.215。隨著篩選輪次的增加,適配子與Ras蛋白結(jié)合率、親和力逐漸增高,第11輪適配子結(jié)合率最高,為32.4%；親和力OD值最高,為1.033。 結(jié)論成功篩選到Ras蛋白的高特異性及親和力ssDNA適配子。 第三部分Ras蛋白ssDNA適配子的克隆、鑒定及序列分析 目的對親和力最高的一輪適配子進(jìn)行克隆、鑒定及測序,獲得適配子序列,分別對其進(jìn)行序列分析及親和力檢測,并探討Ras蛋白ssDNA適配子的構(gòu)象與親和力之間的內(nèi)在規(guī)律。 方法最終篩選得到的親和力最高的一輪ssDNA適配子,經(jīng)PCR擴(kuò)增成dsDNA,回收純化后連接pMD18-T Vector,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞,隨機(jī)挑選50個陽性克隆送生物公司測序。用DNAMAN 5.29軟件包對單個適配子序列進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)同源序列分析及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。把獲得的適配子序列送生物公司合成,并在5’端標(biāo)記生物素,用ELISA法檢測單個適配子與Ras蛋白親和力。把這些適配子序列一級結(jié)構(gòu)同源序列及二級結(jié)構(gòu)特點與親和力高低進(jìn)行比較分析。 結(jié)果50個陽性克隆子(Ral—-Ra50)中有45個的中間隨機(jī)序列和預(yù)期的35個堿基數(shù)一致(Ra1—-Ra45),其中有2個序列完全一樣(Ra1、Ra2)；5個不一致,其中有3個缺失1個堿基(Ra46、Ra47、Ra48),1個缺失2個堿基(Ra49),1個多1個堿基(Ra50)。寡核苷酸適配子的一級結(jié)構(gòu)同源序列分析結(jié)果可分為10個家族,第1—9家族分別含有不同的保守序列,第10家族不含保守序列。二級結(jié)構(gòu)主要為莖環(huán)結(jié)構(gòu),親和力檢測結(jié)果顯示OD值為0.742—1.213之間。其中適配子Ra1、Ra2的OD值最高為1.213,親和力最強(qiáng),且以之為代表的親和力強(qiáng)的適配子的二級結(jié)構(gòu)相對以多個小的莖環(huán)結(jié)構(gòu)為主；適配子Ra27的OD值最低為0.742,親和力最弱,且以之為代表的親和力弱的適配子的二級結(jié)構(gòu)以含相對較大的莖環(huán)結(jié)構(gòu)為主。多數(shù)適配子的保守序列在二級結(jié)構(gòu)中多出現(xiàn)在莖環(huán)交界處,形成折角。 結(jié)論親和力最高的適配子克隆成功,經(jīng)測序,獲得了適配子序列。寡核苷酸適配子的二級結(jié)構(gòu)主要為莖環(huán)結(jié)構(gòu),親和力強(qiáng)的適配子的二級結(jié)構(gòu)以小的莖環(huán)結(jié)構(gòu)為主,具有此特征的莖環(huán)結(jié)構(gòu)很有可能是我們篩選到的適配子與Ras蛋白特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)。而共同的保守序列在莖環(huán)交界處形成折角可能在其中起到了關(guān)鍵作用。為進(jìn)一步提高適配子與靶物質(zhì)的特異性和親和力打下了基礎(chǔ),為后期研究Ras蛋白ssDNA適配子對VSMC增殖、遷移及CHD術(shù)后血管橋再狹窄的影響及機(jī)制提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和一定的理論依據(jù)。
【圖文】：

圖2.1SELEX篩選流程圖(二)ssDNA的準(zhǔn)備第一輪篩選時所用的SsDNA來至隨機(jī)寡核昔酸文庫，所以SsDNA量以后每一輪篩選所用的SsDNA均來至上一輪篩選產(chǎn)物。而每一輪篩選完獲得少量的SsDNA，所以，，必須獲得足量的ssDNA，下一輪篩選刁‘能進(jìn)分以兩種方式制備SsDNA，即間接不對稱PCR和鏈酶親和素磁珠分離。稱PCR制備SsDNA:以上一輪篩選到的SsDNA為模板，通過間接不對增獲得SsDNA。鏈酶親和素磁珠分離制備SsDNA:用生物素引物經(jīng)對稱后，經(jīng)鏈酶親和素磁珠分離獲得SsDNA。最后均經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳鑒ssDNA目的條帶，用EzSpinColumnDNAGelExtraetionKit進(jìn)行回收純大量的ssDNA。--

loobp一一50bp--一圖21一6道分別為第1、適配子PcR產(chǎn)物(dsDNA)經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果s、7、9、11輪適配子PeR產(chǎn)物，7道為 suLlobpdsDNAladder。 150bp-一’100bp-一’50bP---一圖2.3第1、5、11輪適配子 (ssDNA)經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果l一3道分別為第l、5、11輪適配子，4道為 suLlobpdsDNAladder。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2579888