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C-kit陽性心肌干細胞分化為竇房結樣細胞的實驗研究

發(fā)布時間:2020-02-15 22:01
【摘要】:很長時期以來,人們都認為成年哺乳動物的心肌是終末分化組織,沒有再生能力,當炎癥、缺血等原因損害心臟時,受損的心肌組織只能通過疤痕、肥大等方式代償。新近的研究認為,雖然成年心臟中大部分心肌細胞永久地退出了細胞循環(huán),但是心臟組織中有心肌干細胞(cardiac stem cells, CSCs)存在,心肌細胞可以被CSCs更新,心臟是具有內(nèi)在自我更新潛能的器官。這一發(fā)現(xiàn)為臨床干細胞療法治療某些心臟疾病開辟了嶄新的思路。本研究試圖建立一種穩(wěn)定方便的分離和培養(yǎng)CSCs方法,然后對其生長、分化及電生理特性進行研究,觀察CSCs向心肌樣細胞、竇房結樣細胞分化的可能性,以期為將來進一步探討該定向分化的機制和臨床干細胞治療竇房結功能不全提供基礎理論依據(jù)。整個研究分為三部分: 第一部分心肌干細胞的培養(yǎng)、分離、純化和鑒定 目的:建立穩(wěn)定的分離和培養(yǎng)心肌干細胞(CSCs)方法,以及觀察CSCs的生物學特性。方法:無菌操作取下1月齡SD大鼠心臟,經(jīng)PBS液反復沖洗后,剪成小碎塊,然后進行消化,過程如下:根據(jù)組織塊的量加入0.1%Ⅱ型膠原酶溶液2~3ml,37℃振蕩消化5分鐘,吸管棄去消化液,然后加入0.2%胰蛋白酶溶液2~3ml,37℃再振蕩消化5分鐘,吸管棄去消化液。如此重復3次。將所得殘余組織塊進行培養(yǎng)。觀察、收集從培養(yǎng)組織塊中爬出的細胞。以c-kit為標記物,先用流式細胞儀對培養(yǎng)細胞進行c-kit陽性率檢測,然后用該標記物進行細胞分選。之后鑒定分選后細胞的表型,觀察分選后細胞生長、增殖特性。同時比較不同種屬、同一心臟不同部位、不同性別c-kit+純化細胞的增殖能力。結果:消化后的心肌組織塊經(jīng)培養(yǎng)后,可出現(xiàn)小圓形、亮的細胞。這些小圓、亮的細胞多附著在成纖維細胞之上,或者在成纖維細胞周圍,而沒有成纖維細胞的區(qū)域則小圓亮的細胞很少。不是所有組織塊周圍均有小圓、亮的細胞出現(xiàn),也不是所有成纖維細胞附近都有小圓亮的細胞爬出。有些小細胞在從組織塊邊緣爬出來的同時便開始增殖、簇集成小細胞團。收集這些細胞并選用流式細胞儀進行c-kit+分選。流式細胞儀分選結果顯示,送檢單細胞懸液的c-kit陽性率為22.89%。將分選后細胞置于生長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),先用臺盼藍檢測細胞活力,結果顯示所有檢測細胞的活力均大于99.5%。同時流式細胞儀檢測顯示c-kit+細胞的CD34和CD45表達陰性。這些細胞可以呈對稱和不對稱方式增殖,可以呈葡萄狀成簇(cluster)生長,增殖并形成心球樣細胞團結構(cardiosphere)。對稱方式增殖的c-kit+細胞具有生長相對穩(wěn)定、擴增能力較弱的特性,而不對稱方式增殖的c-kit+細胞具有較強的擴增能力,容易簇集成團。之后用上述的方法提取、觀察兔、犬和人的c-kit+純化細胞。比較顯示,不同種屬c-kit+純化細胞的增殖能力差異較大,其中犬的增殖能力最強,其次是兔、大鼠,而人的c-kit+純化細胞的增殖能力最差。選取等量來源于同一犬心臟不同部位的c-kit+純化細胞,比較其增殖能力,結果顯示來源于心尖部位心肌組織的分選細胞增殖速度最快,而來源于心臟中部(包括心房下部和心室上部)心肌的分選細胞增殖速度最慢,來源于心房肌的分選細胞增殖速度介于前兩者之間。在相差顯微鏡的幫助下,共有180個分選后c-kit+細胞被分別單個地放在96孔培養(yǎng)板中。5天后,大約有70%的細胞存活并且開始緩慢增殖,這些存活細胞中的約40%細胞開始簇集成小球團狀細胞。結論:本方法可以對不同種屬心肌組織中c-kit+細胞進行成功的分離和體外培養(yǎng)?梢哉J為分選后c-kit+純化細胞就是表達c-kit陽性的心肌干細胞(CSCs),這些CSCs的表型為c-kit+CD34-CD45-。在培養(yǎng)條件下短期內(nèi)可獲得大量CSCs,可以滿足進一步觀察CSCs定向分化和研究其電生理特性的需要。 第二部分C-kit+心肌干細胞的分化標記物鑒定和電生理檢測 目的:擬通過我們自己改進的培養(yǎng)方法,進一步探討心肌干細胞增殖的特性和分化譜系;研究c-kit+CSCs的電生理特性;探討c-kit+CSCs經(jīng)過培養(yǎng)一段時間后分化為心肌細胞和竇房結細胞的可能性。方法:將分選后純化的犬c-kit+細胞繼續(xù)培養(yǎng)、擴增。分別在培養(yǎng)的第2、4、8周時,在培養(yǎng)皿中制備細胞爬片,然后用免疫熒光方法觀察c-kit+細胞分化譜系的標記物表達,不同分化譜系的標記物分別是:①心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin I, cTnI),是心肌細胞譜系分化標記物;②平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin, SMA),是平滑肌細胞譜系分化標記物;③CD31,是內(nèi)皮細胞譜系分化標記物。之后用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測不同時期的目標基因mRNA表達,包括GATA-4、HCN2和HCN4。同時采用全細胞膜片鉗技術及記錄系統(tǒng),對未分化的c-kit+CSCs進行膜電流檢測。結果:第2周時,采用免疫熒光染色的檢測方法,觀察到細胞的分裂,同時可以看到有些正在分裂細胞的cTnⅠ染色呈陽性,提示在分裂增殖的同時就可以開始細胞的分化。在第4周時,培養(yǎng)細胞表達cTnⅠ、SMA、CD31的陽性率分別是10.5±4.2%、13.5±5.1%和12.9±3.5%。在第8周時上述表達均有增加,培養(yǎng)細胞表達cTnⅠ、SMA、CD31的陽性率分別是23.2±3.6%、25.9±6.6%和28.3±6.1%,各標記物在不同時期陽性率差異分別均有顯著統(tǒng)計學意義,P0.05。經(jīng)過4、8周培養(yǎng)的細胞中有GATA-4、HCN2和HCN4表達,且8周細胞的GATA-4、HCN2、HCN4的表達均分別高于培養(yǎng)4周的細胞,差異有顯著統(tǒng)計學意義,P0.05。對分選后尚未分化的c-kit+細胞進行膜電流檢測,先檢測Na+電流,可以檢測到很低的電流。然后檢測Ca2+電流,此時無明顯電流出現(xiàn),然而將細胞外液換成10mM BaCl2,則可以記錄到較明顯電流。該電流在-35mV時發(fā)生,20-30mV時達到高峰,最強電流是30mv時達-60.5±4.8 pA。結論:在培養(yǎng)條件下,c-kit+CSCs能夠分化為心肌樣細胞和竇房結樣細胞,在未分化c-kit+CSCs的細胞膜上可以記錄到多種內(nèi)向電流,說明該干細胞的細胞膜上存在可以介導內(nèi)向電流的離子通道蛋白,提示c-kit+CSCs有成為生物起搏“種子細胞”的潛力,將來可以在體內(nèi)實驗中進一步觀察分化情況。 第三部分5-氮雜胞苷誘導大鼠心肌干細胞的分化為竇房結樣細胞的研究 目的:盡管CSCs可以分化為竇房結樣細胞,但是在一般培養(yǎng)條件下該定向分化的效率還比較低。只有提高該分化的效率,才有利于進一步研究其分化的分子調(diào)控機制,才有利于進一步探討其臨床價值。為了提高定向分化為竇房結樣細胞的效率,初步探討其分化的機制,選擇5-氮雜胞苷(5-Aazacytidine,5-Aza)誘導作用CSCs,觀察其生長、分化結果。方法:將大鼠的CSCs接種到6孔培養(yǎng)板上進行培養(yǎng)。分別用含有5、10、15μmol/L 5-氮雜胞苷誘導培養(yǎng)24h。然后觀察不同濃度5-Aza對CSCs生長的影響,檢測誘導后c-kit+CSCs分化譜系的標記物表達,用RT-PCR方法檢測GATA-4、HCN2和HCN4的mRNA表達。最后選擇膜片鉗技術及記錄系統(tǒng),對未分化的c-kit+CSCs進行膜電流檢測。結果:與對照組比較,各誘導組均有較多細胞死亡、溶解。5-Aza濃度越高,細胞生長越慢,增殖速度越慢。誘導后3天,出現(xiàn)較多的小圓球形細胞貼壁生長,培養(yǎng)一周后,一些細胞的體積增大,并向四周延伸,形成梭狀形態(tài)。免疫熒光檢測顯示,經(jīng)過0、5 and 10μM 5-Aza誘導后培養(yǎng)8周的細胞表達cTnl的陽性率分別是18.7±4.3%、19.2±7.2%和32.6±8.5%;表達GATA-4的陽性率分別是21.4±8.1%、22.6±3.4%和31.4±2.6%; 10μM 5-Aza誘導后的培養(yǎng)細胞表達cTnl和GATA-4的陽性率最高,P0.05,同時表達HCN4的陽性率為11.7±4.2%。對未分化CSCs的膜電流檢測顯示,未檢測到Na+電流,檢測Ca2+電流時有很低的電流出現(xiàn),再次將細胞外液換成10mMBaCl2,則可以記錄到較強電流。該電流在-40mV時發(fā)生,10-20mV時達到高峰,最強電流是10mv時達-61.5±2.8 pA。在誘導后第28~33天,培養(yǎng)細胞中出現(xiàn)了2個輕微搏動的細胞。高倍顯微鏡下仔細觀察,在底部快鋪滿細胞的培養(yǎng)皿中可見略呈紡錘形的分化細胞在低幅度的搏動,搏動頻率為35~65次/分。搏動持續(xù)時間不足24小時。結論:10μM 5-Aza聯(lián)合一定濃度的堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)有增強CSCs分化為心肌樣細胞和竇房結樣細胞的作用。盡管10μmol/L 5-Aza對CSCs的生長有一定的毒副作用,但存活下來的細胞分化效率更高,分化為竇房結樣細胞的陽性率也增高,極少量培養(yǎng)細胞在一段時期后還出現(xiàn)了微弱的搏動。該濃度(10μM)的5-Aza對未分化CSCs的細胞膜離子通道蛋白的表達沒有明顯抑制作用。說明10μM 5-Aza比較適合作為誘導CSCs的常用誘導劑。不過,誘導結果表明所觀察的三個細胞譜系的分化效率都比對照組高,這說明在誘導后的兩個月內(nèi)該誘導劑的作用效果主要是把CSCs全面分化的潛力發(fā)揮了出來,至少在觀察的8周時間內(nèi)沒有明顯體現(xiàn)出特異的主要向心肌細胞和竇房結細胞分化的潛力。
【圖文】:

空間圖,心肌組織,培養(yǎng)皿,直徑


用吸管將消化后組織塊移入直徑為6cm的培養(yǎng)皿中,使組織塊均勻鋪開,保持組織塊之間有足夠的空間,并加入少量培養(yǎng)液。參見圖1一1.圖1一1培養(yǎng)心肌組織塊(培養(yǎng)皿直徑6cm)Figurel一 1Theeultureofmineedeardiaemuseletissue.

未分化,細胞膜


圖2一4未分化e一kit+CSCS細胞膜內(nèi)向電流檢測(A一F)(圖A.x4OO)igureZ一4Reeordi一191一lwardeurre一ltsofCSCs.(A)Tllero:lrldeellwast一sedforelectroPllysiologiceeordi一195(一:otethepateh一eleetrode):(B)eurrenttraeeswereshownintheprese一IceofZmMeae,o)origina一currenttraeesofarepresentativeeel一weres一lowninthepreseneeof一0mMBaE,,F(xiàn))ThelowNa+eurrentwasreeorded:36
【學位授予單位】:武漢大學
【學位級別】:博士
【學位授予年份】:2011
【分類號】:R329

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 Bartosz Balana;Cecilia Nicolett;Ihor Zahanich;Eva M Graf;Torsten Christ;Sabine Boxberger;;5-Azacytidine induces changes in electrophysiological properties of human mesenchymal stem cells[J];Cell Research;2006年12期



本文編號:2579933

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