【摘要】：很長時期以來,人們都認(rèn)為成年哺乳動物的心肌是終末分化組織,沒有再生能力,當(dāng)炎癥、缺血等原因損害心臟時,受損的心肌組織只能通過疤痕、肥大等方式代償。新近的研究認(rèn)為,雖然成年心臟中大部分心肌細(xì)胞永久地退出了細(xì)胞循環(huán),但是心臟組織中有心肌干細(xì)胞(cardiac stem cells, CSCs)存在,心肌細(xì)胞可以被CSCs更新,心臟是具有內(nèi)在自我更新潛能的器官。這一發(fā)現(xiàn)為臨床干細(xì)胞療法治療某些心臟疾病開辟了嶄新的思路。本研究試圖建立一種穩(wěn)定方便的分離和培養(yǎng)CSCs方法,然后對其生長、分化及電生理特性進(jìn)行研究,觀察CSCs向心肌樣細(xì)胞、竇房結(jié)樣細(xì)胞分化的可能性,以期為將來進(jìn)一步探討該定向分化的機(jī)制和臨床干細(xì)胞治療竇房結(jié)功能不全提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。整個研究分為三部分： 第一部分心肌干細(xì)胞的培養(yǎng)、分離、純化和鑒定 目的：建立穩(wěn)定的分離和培養(yǎng)心肌干細(xì)胞(CSCs)方法,以及觀察CSCs的生物學(xué)特性。方法：無菌操作取下1月齡SD大鼠心臟,經(jīng)PBS液反復(fù)沖洗后,剪成小碎塊,然后進(jìn)行消化,過程如下：根據(jù)組織塊的量加入0.1%Ⅱ型膠原酶溶液2～3ml,37℃振蕩消化5分鐘,吸管棄去消化液,然后加入0.2%胰蛋白酶溶液2～3ml,37℃再振蕩消化5分鐘,吸管棄去消化液。如此重復(fù)3次。將所得殘余組織塊進(jìn)行培養(yǎng)。觀察、收集從培養(yǎng)組織塊中爬出的細(xì)胞。以c-kit為標(biāo)記物,先用流式細(xì)胞儀對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行c-kit陽性率檢測,然后用該標(biāo)記物進(jìn)行細(xì)胞分選。之后鑒定分選后細(xì)胞的表型,觀察分選后細(xì)胞生長、增殖特性。同時比較不同種屬、同一心臟不同部位、不同性別c-kit+純化細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果：消化后的心肌組織塊經(jīng)培養(yǎng)后,可出現(xiàn)小圓形、亮的細(xì)胞。這些小圓、亮的細(xì)胞多附著在成纖維細(xì)胞之上,或者在成纖維細(xì)胞周圍,而沒有成纖維細(xì)胞的區(qū)域則小圓亮的細(xì)胞很少。不是所有組織塊周圍均有小圓、亮的細(xì)胞出現(xiàn),也不是所有成纖維細(xì)胞附近都有小圓亮的細(xì)胞爬出。有些小細(xì)胞在從組織塊邊緣爬出來的同時便開始增殖、簇集成小細(xì)胞團(tuán)。收集這些細(xì)胞并選用流式細(xì)胞儀進(jìn)行c-kit+分選。流式細(xì)胞儀分選結(jié)果顯示,送檢單細(xì)胞懸液的c-kit陽性率為22.89%。將分選后細(xì)胞置于生長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),先用臺盼藍(lán)檢測細(xì)胞活力,結(jié)果顯示所有檢測細(xì)胞的活力均大于99.5%。同時流式細(xì)胞儀檢測顯示c-kit+細(xì)胞的CD34和CD45表達(dá)陰性。這些細(xì)胞可以呈對稱和不對稱方式增殖,可以呈葡萄狀成簇(cluster)生長,增殖并形成心球樣細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)(cardiosphere)。對稱方式增殖的c-kit+細(xì)胞具有生長相對穩(wěn)定、擴(kuò)增能力較弱的特性,而不對稱方式增殖的c-kit+細(xì)胞具有較強(qiáng)的擴(kuò)增能力,容易簇集成團(tuán)。之后用上述的方法提取、觀察兔、犬和人的c-kit+純化細(xì)胞。比較顯示,不同種屬c-kit+純化細(xì)胞的增殖能力差異較大,其中犬的增殖能力最強(qiáng),其次是兔、大鼠,而人的c-kit+純化細(xì)胞的增殖能力最差。選取等量來源于同一犬心臟不同部位的c-kit+純化細(xì)胞,比較其增殖能力,結(jié)果顯示來源于心尖部位心肌組織的分選細(xì)胞增殖速度最快,而來源于心臟中部(包括心房下部和心室上部)心肌的分選細(xì)胞增殖速度最慢,來源于心房肌的分選細(xì)胞增殖速度介于前兩者之間。在相差顯微鏡的幫助下,共有180個分選后c-kit+細(xì)胞被分別單個地放在96孔培養(yǎng)板中。5天后,大約有70%的細(xì)胞存活并且開始緩慢增殖,這些存活細(xì)胞中的約40%細(xì)胞開始簇集成小球團(tuán)狀細(xì)胞。結(jié)論：本方法可以對不同種屬心肌組織中c-kit+細(xì)胞進(jìn)行成功的分離和體外培養(yǎng)�？梢哉J(rèn)為分選后c-kit+純化細(xì)胞就是表達(dá)c-kit陽性的心肌干細(xì)胞(CSCs),這些CSCs的表型為c-kit+CD34-CD45-。在培養(yǎng)條件下短期內(nèi)可獲得大量CSCs,可以滿足進(jìn)一步觀察CSCs定向分化和研究其電生理特性的需要。 第二部分C-kit+心肌干細(xì)胞的分化標(biāo)記物鑒定和電生理檢測 目的：擬通過我們自己改進(jìn)的培養(yǎng)方法,進(jìn)一步探討心肌干細(xì)胞增殖的特性和分化譜系；研究c-kit+CSCs的電生理特性；探討c-kit+CSCs經(jīng)過培養(yǎng)一段時間后分化為心肌細(xì)胞和竇房結(jié)細(xì)胞的可能性。方法：將分選后純化的犬c-kit+細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)、擴(kuò)增。分別在培養(yǎng)的第2、4、8周時,在培養(yǎng)皿中制備細(xì)胞爬片,然后用免疫熒光方法觀察c-kit+細(xì)胞分化譜系的標(biāo)記物表達(dá),不同分化譜系的標(biāo)記物分別是：①心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin I, cTnI),是心肌細(xì)胞譜系分化標(biāo)記物；②平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin, SMA),是平滑肌細(xì)胞譜系分化標(biāo)記物；③CD31,是內(nèi)皮細(xì)胞譜系分化標(biāo)記物。之后用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測不同時期的目標(biāo)基因mRNA表達(dá),包括GATA-4、HCN2和HCN4。同時采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)及記錄系統(tǒng),對未分化的c-kit+CSCs進(jìn)行膜電流檢測。結(jié)果：第2周時,采用免疫熒光染色的檢測方法,觀察到細(xì)胞的分裂,同時可以看到有些正在分裂細(xì)胞的cTnⅠ染色呈陽性,提示在分裂增殖的同時就可以開始細(xì)胞的分化。在第4周時,培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)cTnⅠ、SMA、CD31的陽性率分別是10.5±4.2%、13.5±5.1%和12.9±3.5%。在第8周時上述表達(dá)均有增加,培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)cTnⅠ、SMA、CD31的陽性率分別是23.2±3.6%、25.9±6.6%和28.3±6.1%,各標(biāo)記物在不同時期陽性率差異分別均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。經(jīng)過4、8周培養(yǎng)的細(xì)胞中有GATA-4、HCN2和HCN4表達(dá),且8周細(xì)胞的GATA-4、HCN2、HCN4的表達(dá)均分別高于培養(yǎng)4周的細(xì)胞,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。對分選后尚未分化的c-kit+細(xì)胞進(jìn)行膜電流檢測,先檢測Na+電流,可以檢測到很低的電流。然后檢測Ca2+電流,此時無明顯電流出現(xiàn),然而將細(xì)胞外液換成10mM BaCl2,則可以記錄到較明顯電流。該電流在-35mV時發(fā)生,20-30mV時達(dá)到高峰,最強(qiáng)電流是30mv時達(dá)-60.5±4.8 pA。結(jié)論：在培養(yǎng)條件下,c-kit+CSCs能夠分化為心肌樣細(xì)胞和竇房結(jié)樣細(xì)胞,在未分化c-kit+CSCs的細(xì)胞膜上可以記錄到多種內(nèi)向電流,說明該干細(xì)胞的細(xì)胞膜上存在可以介導(dǎo)內(nèi)向電流的離子通道蛋白,提示c-kit+CSCs有成為生物起搏“種子細(xì)胞”的潛力,將來可以在體內(nèi)實驗中進(jìn)一步觀察分化情況。 第三部分5-氮雜胞苷誘導(dǎo)大鼠心肌干細(xì)胞的分化為竇房結(jié)樣細(xì)胞的研究 目的：盡管CSCs可以分化為竇房結(jié)樣細(xì)胞,但是在一般培養(yǎng)條件下該定向分化的效率還比較低。只有提高該分化的效率,才有利于進(jìn)一步研究其分化的分子調(diào)控機(jī)制,才有利于進(jìn)一步探討其臨床價值。為了提高定向分化為竇房結(jié)樣細(xì)胞的效率,初步探討其分化的機(jī)制,選擇5-氮雜胞苷(5-Aazacytidine,5-Aza)誘導(dǎo)作用CSCs,觀察其生長、分化結(jié)果。方法：將大鼠的CSCs接種到6孔培養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng)。分別用含有5、10、15μmol/L 5-氮雜胞苷誘導(dǎo)培養(yǎng)24h。然后觀察不同濃度5-Aza對CSCs生長的影響,檢測誘導(dǎo)后c-kit+CSCs分化譜系的標(biāo)記物表達(dá),用RT-PCR方法檢測GATA-4、HCN2和HCN4的mRNA表達(dá)。最后選擇膜片鉗技術(shù)及記錄系統(tǒng),對未分化的c-kit+CSCs進(jìn)行膜電流檢測。結(jié)果：與對照組比較,各誘導(dǎo)組均有較多細(xì)胞死亡、溶解。5-Aza濃度越高,細(xì)胞生長越慢,增殖速度越慢。誘導(dǎo)后3天,出現(xiàn)較多的小圓球形細(xì)胞貼壁生長,培養(yǎng)一周后,一些細(xì)胞的體積增大,并向四周延伸,形成梭狀形態(tài)。免疫熒光檢測顯示,經(jīng)過0、5 and 10μM 5-Aza誘導(dǎo)后培養(yǎng)8周的細(xì)胞表達(dá)cTnl的陽性率分別是18.7±4.3%、19.2±7.2%和32.6±8.5%；表達(dá)GATA-4的陽性率分別是21.4±8.1%、22.6±3.4%和31.4±2.6%; 10μM 5-Aza誘導(dǎo)后的培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)cTnl和GATA-4的陽性率最高,P0.05,同時表達(dá)HCN4的陽性率為11.7±4.2%。對未分化CSCs的膜電流檢測顯示,未檢測到Na+電流,檢測Ca2+電流時有很低的電流出現(xiàn),再次將細(xì)胞外液換成10mMBaCl2,則可以記錄到較強(qiáng)電流。該電流在-40mV時發(fā)生,10-20mV時達(dá)到高峰,最強(qiáng)電流是10mv時達(dá)-61.5±2.8 pA。在誘導(dǎo)后第28～33天,培養(yǎng)細(xì)胞中出現(xiàn)了2個輕微搏動的細(xì)胞。高倍顯微鏡下仔細(xì)觀察,在底部快鋪滿細(xì)胞的培養(yǎng)皿中可見略呈紡錘形的分化細(xì)胞在低幅度的搏動,搏動頻率為35～65次/分。搏動持續(xù)時間不足24小時。結(jié)論：10μM 5-Aza聯(lián)合一定濃度的堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)有增強(qiáng)CSCs分化為心肌樣細(xì)胞和竇房結(jié)樣細(xì)胞的作用。盡管10μmol/L 5-Aza對CSCs的生長有一定的毒副作用,但存活下來的細(xì)胞分化效率更高,分化為竇房結(jié)樣細(xì)胞的陽性率也增高,極少量培養(yǎng)細(xì)胞在一段時期后還出現(xiàn)了微弱的搏動。該濃度(10μM)的5-Aza對未分化CSCs的細(xì)胞膜離子通道蛋白的表達(dá)沒有明顯抑制作用。說明10μM 5-Aza比較適合作為誘導(dǎo)CSCs的常用誘導(dǎo)劑。不過,誘導(dǎo)結(jié)果表明所觀察的三個細(xì)胞譜系的分化效率都比對照組高,這說明在誘導(dǎo)后的兩個月內(nèi)該誘導(dǎo)劑的作用效果主要是把CSCs全面分化的潛力發(fā)揮了出來,至少在觀察的8周時間內(nèi)沒有明顯體現(xiàn)出特異的主要向心肌細(xì)胞和竇房結(jié)細(xì)胞分化的潛力。
【圖文】：

用吸管將消化后組織塊移入直徑為6cm的培養(yǎng)皿中，使組織塊均勻鋪開，保持組織塊之間有足夠的空間，并加入少量培養(yǎng)液。參見圖1一1.圖1一1培養(yǎng)心肌組織塊(培養(yǎng)皿直徑6cm)Figurel一 1Theeultureofmineedeardiaemuseletissue.

圖2一4未分化e一kit+CSCS細(xì)胞膜內(nèi)向電流檢測(A一F)(圖A.x4OO)igureZ一4Reeordi一191一lwardeurre一ltsofCSCs.(A)Tllero:lrldeellwast一sedforelectroPllysiologiceeordi一195(一:otethepateh一eleetrode):(B)eurrenttraeeswereshownintheprese一IceofZmMeae，o)origina一currenttraeesofarepresentativeeel一weres一lowninthepreseneeof一0mMBaE，，F(xiàn))ThelowNa+eurrentwasreeorded:36
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 Bartosz Balana;Cecilia Nicolett;Ihor Zahanich;Eva M Graf;Torsten Christ;Sabine Boxberger;;5-Azacytidine induces changes in electrophysiological properties of human mesenchymal stem cells[J];Cell Research;2006年12期

本文編號：2579933