【摘要】：目前,原位肝移植OLT (orthotopic liver transplantation, OLT)無疑是治療終末期肝病最為有效的方法。然而,供肝嚴(yán)重短缺、急慢性排斥反應(yīng)的存在以及長期應(yīng)用免疫抑制劑所帶來的毒副作用是肝移植所面臨的三大問題。肝細(xì)胞移植(HCT)和生物人工肝(bioartificial liver, BAL)作為一種有望部分替代原位肝移植的嶄新而有效的方法受到廣泛關(guān)注,以干細(xì)胞為種子細(xì)胞的細(xì)胞治療和組織再生也顯示出越來越廣闊的臨床應(yīng)用前景。因此,基于干細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)上的肝臟再生為人們突破終末期肝病治療所面臨困境帶來希望。本研究主要開展基于干細(xì)胞技術(shù)的肝臟損傷再生相關(guān)研究：研制適用于生物人工肝或直接進(jìn)行體內(nèi)移植的微囊化肝細(xì)胞；探討人胚胎干細(xì)胞向定型內(nèi)胚層細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制,為進(jìn)一步優(yōu)化干細(xì)胞向肝細(xì)胞的誘導(dǎo)體系以及提高誘導(dǎo)分化效率打下基礎(chǔ)。 本研究主要包括兩部分內(nèi)容： 一、微囊化混合共培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞與轉(zhuǎn)bFGF胎肝基質(zhì)細(xì)胞治療小鼠急性肝衰竭的實驗性研究 本部分實驗通過體外平面和微囊化共培養(yǎng)轉(zhuǎn)bFGF的胎肝基質(zhì)細(xì)胞和大鼠原代肝細(xì)胞,證明轉(zhuǎn)bFGF的胎肝基質(zhì)細(xì)胞有助于成熟肝細(xì)胞生物學(xué)功能發(fā)揮及壽命維持,并在傳統(tǒng)的微囊化三維培養(yǎng)肝細(xì)胞的基礎(chǔ)上,將對肝細(xì)胞的增殖和壽命維持起支持作用的胎肝基質(zhì)細(xì)胞和轉(zhuǎn)bFGF的胎肝基質(zhì)細(xì)胞與大鼠原代肝細(xì)胞混合微囊化,發(fā)現(xiàn)微囊化混合培養(yǎng)轉(zhuǎn)bFGF的胎肝基質(zhì)細(xì)胞能夠提高和維持原代肝細(xì)胞的各項功能指標(biāo)。隨后展開的體內(nèi)移植試驗,將其移植入急性肝衰竭小鼠模型的腹腔內(nèi),觀察微囊化混合肝細(xì)胞對肝衰竭小鼠肝功能恢復(fù)所起的作用,以及移植后的肝衰竭小鼠的存活率及肝組織學(xué)的改變。通過實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)bFGF胎肝基質(zhì)細(xì)胞的存在能通過維持移植的微囊內(nèi)肝細(xì)胞的功能,明顯促進(jìn)肝衰竭小鼠的肝再生,從而提高了肝衰竭小鼠的存活率,并有利于小鼠的長期存活。本實驗為肝細(xì)胞移植及生物人工肝等提供新的途徑,為生物人工肝最終能應(yīng)用終末期肝病的治療打下基礎(chǔ)。但是目前肝細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量一直是生物人工肝臨床應(yīng)用中難以突破的核心問題。干細(xì)胞本身所具有的特性可以使其在體外擴(kuò)增培養(yǎng)并定向誘導(dǎo)分化為人們所需的各種組織細(xì)胞,從而有望為生物人工肝提供足夠數(shù)量的肝細(xì)胞來源。 二、人胚胎干細(xì)胞向定型內(nèi)胚層分化的調(diào)控機(jī)制研究 干細(xì)胞向肝臟細(xì)胞的誘導(dǎo)分化中存在著一系列的問題亟待解決,其中最為重要的問題是關(guān)于胚胎干細(xì)胞或者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞如何誘導(dǎo)分化為內(nèi)胚層細(xì)胞,尤其是肝細(xì)胞的機(jī)制目前還遠(yuǎn)不清楚,這極大限制了干細(xì)胞向肝臟細(xì)胞誘導(dǎo)分化的效率。本部分實驗,我們建立在無血清無滋養(yǎng)層的體系下誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向定型內(nèi)胚層細(xì)胞分化的模型。在此基礎(chǔ)上,通過miRNA生物芯片比較篩選人胚胎干細(xì)胞向定型內(nèi)胚層分化前后表達(dá)差異的miRNA,以期得到參與定型內(nèi)胚層分化的候選miRNA。通過生物信息學(xué)分析表達(dá)差異miRNA的靶基因,發(fā)現(xiàn)CTGF可能在胚胎干細(xì)胞自我維持和分化過程中起重要的作用。與此同時,結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),通過2D-DIGE和質(zhì)譜鑒別大規(guī)模篩選在該階段表達(dá)量發(fā)生明顯變化的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)人胚胎干細(xì)胞向定型內(nèi)胚層分化過程中潛在的標(biāo)志和可能在定型內(nèi)胚層分化和發(fā)育過程中起重要作用的蛋白質(zhì)。這些結(jié)果進(jìn)一步闡述了人胚胎干細(xì)胞向定型內(nèi)胚層分化過程中的分子機(jī)制。 綜上,以上研究證明了微囊化混合共培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞與轉(zhuǎn)bFGF胎肝基質(zhì)細(xì)胞能夠明顯促進(jìn)肝衰竭小鼠的肝再生,有助于為肝衰竭等終末期肝病的治療提供新的手段。與此同時,本研究還探討人胚胎干細(xì)胞向定向內(nèi)胚層細(xì)胞的分化機(jī)制,為最終建立高效的誘導(dǎo)分化策略奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

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本文編號：2577337