【摘要】：甲型流感病毒屬于正黏病毒科,基因組由8股負(fù)鏈的RNA組成,其中第8節(jié)段RNA編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1,該蛋白在受感染的宿主細(xì)胞中合成,在調(diào)控病毒致病性和毒力,影響宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)及凋亡等多個方面具有重要作用。 本研究利用生物信息學(xué)分析軟件對2009年甲型流感NS1(2009NS1)和1918年流感NS1(1918NS1)蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析,2009NS1蛋白與1918NS1蛋白相比較,在C端缺失了RKMARTIKSE 10個氨基酸,即PL結(jié)構(gòu)域。其余位點(diǎn)共發(fā)生了32個氨基酸變異。 為進(jìn)一步研究甲型流感病毒NS1蛋白對真核細(xì)胞的作用,本研究通過RT-PCR技術(shù)克隆了2009NS1基因、全基因合成獲得了1918NS1,應(yīng)用pNTAP-B、pCMV-HA、pEGFP-C1載體,構(gòu)建了TAPNS12009、HANS12009、HANS11918等5種NS1真核表達(dá)載體。利用脂質(zhì)體法將重組載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,應(yīng)用Western Blot方法,檢測NS1蛋白表達(dá)量,通過對轉(zhuǎn)染試劑體積、質(zhì)粒質(zhì)量等優(yōu)化,獲得高效轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞條件為:脂質(zhì)體2000 9μL,質(zhì)粒2μg,瞬轉(zhuǎn)NS1 96h后,NS1蛋白的表達(dá)量達(dá)最高值。 應(yīng)用2009NS1、1918NS1真核表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,利用顯微鏡觀察表達(dá)NS1蛋白的A549細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞出現(xiàn)皺縮,體積變小,變圓,細(xì)胞核固縮,染色質(zhì)邊緣化等細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。應(yīng)用AnnexinV染色法檢測細(xì)胞凋亡,實(shí)驗組陽性細(xì)胞數(shù)均高于空白和陰性對照組,且A549/1918NS1的陽性細(xì)胞數(shù)高于A549/2009 NS1;利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗組細(xì)胞周期發(fā)生G2/M期阻滯,且A549/1918NS1 G2/M期與Apoptotic期的細(xì)胞比例均大于A549/2009NS1;利用Western Blot方法檢測NS1蛋白對細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白的影響,發(fā)現(xiàn)NS1蛋白可上調(diào)p53、p21蛋白的表達(dá),同時能促進(jìn)p53蛋白15位Ser的磷酸化,且1918NS1蛋白對這些蛋白的作用大于2009NS1蛋白。結(jié)合以上結(jié)果推測NS1蛋白能夠通過上調(diào)p53、p21蛋白表達(dá)、促進(jìn)p53磷酸化,使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,同時誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡,1918NS1作用強(qiáng)于2009NS1,可能與2009NS1缺失PL結(jié)構(gòu)域有關(guān)。 應(yīng)用TAP親和純化技術(shù)獲得TAPNS1蛋白與其相互作用蛋白的復(fù)合物,通過Western blot檢測NS1相互作用蛋白Nucleolin,GST Pull Down技術(shù)進(jìn)一步驗證了NS1蛋白與Nucleolin具有相互作用,且相互作用位點(diǎn)位于NS1 1-82aa。這為進(jìn)一步研究NS1蛋白調(diào)控真核細(xì)胞細(xì)胞周期及誘導(dǎo)其凋亡的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-1. 流感病毒 NS1 蛋白結(jié)構(gòu)圖Fig.1-1 The structure of Influenza NS1 proteinStructure of Swine Flu Virus NS1 Effector Domain from HA/California/07/2009—3M5R）

圖 2-2. 2009NS1 基因 RT-PCR 擴(kuò)增g.2-2. The amplification of 2009NS1 gene by RNAMarker；1，，2009NS1 RT-PCR 擴(kuò)增
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 王慷慨,肖獻(xiàn)忠;核仁素在細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡中的作用[J];中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2004年06期

2 劉紅旗,劉秀梵,張如寬;A型流感病毒蛋白研究進(jìn)展[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2002年02期

3 伍銳,金梅林,陳煥春,蔣增海;豬流感病毒研究進(jìn)展[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2004年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 烏新林;野生型p53基因轉(zhuǎn)染對人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)、生長抑制及基因表達(dá)譜調(diào)控的研究[D];山東大學(xué);2005年

本文編號：2577220