【摘要】：作為地球上分布最廣的金屬元素,鐵在自然界中的含量可以說(shuō)是相當(dāng)豐富,但是大部分鐵都是以難溶的氧化態(tài)存在,這種狀態(tài)的鐵元素難以被微生物利用。而且過(guò)量的鐵對(duì)生物體還有潛在的危害性,在富氧條件下,細(xì)胞內(nèi)的呼吸作用會(huì)產(chǎn)生一些過(guò)氧化物和H2O2,亞鐵離子能夠與過(guò)氧化氫通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生對(duì)生物體有害的氫氧根自由基,氫氧根自由基能夠通過(guò)氧化反應(yīng)破壞諸如蛋白質(zhì)、核酸、脂肪等生物大分子。因此,生物體需要精確控制體內(nèi)游離鐵的含量,在宿主體內(nèi),冗余的鐵元素被轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白等鐵蛋白螯合掉,能供微生物利用的鐵元素少之又少。而鐵對(duì)于微生物的生長(zhǎng)繁殖又是必需的,為了獲得鐵元素,一些細(xì)菌和真菌類(lèi)能夠合成一種能夠高效螯合鐵離子的小分子化合物-鐵載體,來(lái)獲得所需要的鐵元素。從與鐵配位的亞體的角度來(lái)看,鐵載體可以分成四大類(lèi)：兒茶酚型鐵載體、羥基氧肟酸型鐵載體、羧酸類(lèi)鐵載體,還有一類(lèi)是前面三類(lèi)的混合型鐵載體。這些種類(lèi)的鐵載體中,兒茶酚型鐵載體對(duì)鐵的親和力最高,這種鐵載體大部分是通過(guò)2,3-二羥基苯甲酸亞體上的氧原子與鐵進(jìn)行六配位,其復(fù)合物表現(xiàn)出三個(gè)單位的負(fù)電荷。目前為止發(fā)現(xiàn)的對(duì)鐵親和力最高的兒茶酚型鐵載體-腸菌素與鐵作用,其解離常數(shù)可達(dá)10-52。兒茶酚型鐵載體的另一個(gè)代表成員是由霍亂弧菌合成的弧菌素分子,它的分子骨架由反亞精胺、蘇氨酸和2,3-二羥基苯甲酸三部分構(gòu)成。 微生物進(jìn)入宿主中之后,會(huì)通過(guò)合成鐵載體的方式來(lái)獲得鐵元素,為了應(yīng)對(duì)微生物的這種入侵,阻止微生物獲得所需要的鐵元素,哺乳動(dòng)物能夠合成一種叫siderocalin的免疫蛋白,這種免疫蛋白后來(lái)證實(shí)它能夠高效地捕獲兒茶酚型鐵載體-腸菌素,Raymond等人通過(guò)用腸菌素對(duì)siderocalin熒光淬滅的實(shí)驗(yàn)得出siderocalin蛋白對(duì)腸菌素的親和力相當(dāng)高,解離常數(shù)可以達(dá)到納摩爾的級(jí)別。因此,腸菌素分子雖然對(duì)鐵的螯合性非常強(qiáng),但在siderocalin免疫蛋白的作用下,螯合了鐵離子的腸菌素分子并不能被大腸桿菌收回運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)供其利用,從而在這個(gè)過(guò)程中siderocalin蛋白起到了免疫殺菌的作用。為了逃避宿主siderocalin蛋白的免疫過(guò)程,一些致病腸道菌譬如沙門(mén)氏菌、克雷伯氏菌等能夠?qū)铣沙鰜?lái)的腸菌素進(jìn)行糖基化修飾,使得腸菌素的骨架變長(zhǎng),這樣經(jīng)過(guò)修飾的腸菌素由于骨架變大便不能被被siderocalin蛋白捕獲。這樣修飾腸菌素的代價(jià)是腸菌素不能保持像本體狀態(tài)那樣對(duì)鐵離子的極高的親和力,但是卻能夠逃避siderocalin免疫蛋白的捕獲,為致病腸道菌提供所必要的鐵元素。逃逸宿主siderocalin蛋白免疫過(guò)程的另個(gè)機(jī)制是炭疽桿菌的“偷襲機(jī)制”,它并不是在原有的鐵載體基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行修飾,而是在鐵載體合成過(guò)程中利用了一種在其他鐵載體中很少見(jiàn)的3,4-二羥基苯甲酸亞體,通過(guò)這個(gè)亞體上的氧原子與鐵進(jìn)行配位,與鐵配位后,Rebecca等人證實(shí)這種鐵載體在與siderocalin蛋白作用時(shí)會(huì)產(chǎn)生空間位阻,使得siderocalin免疫蛋白無(wú)法捕獲這種特殊的鐵載體。 霍亂弧菌是霍亂的病原體,能夠引起嘔吐、腹瀉等癥狀�；【厥腔魜y弧菌在低鐵環(huán)境下合成的一種兒茶酚型鐵載體,關(guān)于弧菌素分子與鐵離子的配位方式,Griffiths等人認(rèn)為其第二個(gè)惡唑環(huán)上的氮原子也參與了配位,即五個(gè)氧原子和一個(gè)氮原子與鐵配位,而Miethke等人認(rèn)為是三個(gè)兒茶酚亞體上的六個(gè)氧原子與鐵進(jìn)行配位,那么弧菌素分子到底通過(guò)什么原子和鐵離子配位,它是否也能逃逸siderocalin蛋白的免疫過(guò)程。并且,在體外環(huán)境中結(jié)合了鐵離子之后,弧菌素分子是如何被識(shí)別并轉(zhuǎn)運(yùn)至霍亂弧菌細(xì)胞內(nèi)部被利用也是人們比較關(guān)心的一個(gè)問(wèn)題,這些都可以通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的手段來(lái)解決。 在弧菌素分子由細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程中,ViuP蛋白是其中的周質(zhì)空間轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,它的作用是把帶鐵弧菌素由外膜孔蛋白ViuA轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)膜上的ABC體系ViuDGC蛋白,在帶鐵弧菌素的運(yùn)輸中起到了承前啟后的作用。我們的課題的第一部分就是試圖通過(guò)解析Viup蛋白和ViuP與帶鐵弧菌素復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu),來(lái)闡明ViuP蛋白與弧菌素分子的作用機(jī)制,以及弧菌素分子與鐵離子真正的配位模式。通過(guò)這部分的實(shí)驗(yàn),我們得到了以下結(jié)果： 1) ViuP蛋白分子整體結(jié)構(gòu)是兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的球狀結(jié)構(gòu)域被一段α螺旋結(jié)構(gòu)連接,屬于第三類(lèi)周質(zhì)空間轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族,在帶鐵弧菌素結(jié)合前和結(jié)合后ViuP蛋白的整體結(jié)構(gòu)基本上不發(fā)生明顯變化； 2)通過(guò)對(duì)比ViuP蛋白和其他兒茶酚型鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的三維結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)ViuP蛋白的弧菌素結(jié)合口袋的方向與其他的鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物結(jié)合口袋的方向相反,因此,ViuP蛋白從進(jìn)化角度上來(lái)說(shuō)可能來(lái)源于不同于其他的鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的新的家族； 3) ViuP與帶鐵弧菌素的復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)(1.45A)證實(shí)弧菌素分子是通過(guò)五個(gè)氧原子和一個(gè)氮原子與鐵離子配位,這種獨(dú)特的配位方式使帶鐵弧菌素分子表現(xiàn)出兩個(gè)單位的負(fù)電荷； 4)通過(guò)對(duì)siderocalin蛋白的熒光淬滅實(shí)驗(yàn),表明siderocalin不能像螯合腸菌素分子那樣高效地捕獲帶鐵弧菌素分子,分析判斷可能與帶鐵弧菌素分子特殊的鐵配位形式有關(guān)。 本課題的另一部分是關(guān)于腸菌素分子的周質(zhì)空間轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能分析。作為最高效的兒茶酚型鐵載體,腸菌素結(jié)合蛋白目前已有一些研究,其外膜結(jié)合蛋白FepA的結(jié)構(gòu)于1999年被發(fā)表。FepA蛋白識(shí)別并結(jié)合帶鐵腸菌素分子后,將腸菌素轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間,在周質(zhì)空間內(nèi),再由FepB蛋白將帶鐵腸菌素分子轉(zhuǎn)移給內(nèi)膜上的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。FepB蛋白是如何識(shí)別并轉(zhuǎn)運(yùn)腸菌素分子,它與下游的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是如何相瓦作用的,我們通過(guò)解析FepB蛋白與帶鐵腸菌素復(fù)合物的結(jié)構(gòu)對(duì)這些問(wèn)題有了初步的回答。通過(guò)這部分的結(jié)構(gòu)與功能實(shí)驗(yàn),我們得到了以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1) FepB蛋白分子整體結(jié)構(gòu)也是兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的球伏結(jié)構(gòu)域被一段α螺旋結(jié)構(gòu)連接,符合第三類(lèi)周質(zhì)空間轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的基本特征； 2)通過(guò)對(duì)比FepB蛋白和ViuP蛋白以及其他的兒茶酚型鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的三維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),FepB蛋白的腸菌素結(jié)合的口袋方向與ViuP蛋白一致,而與其他的鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都相反,這說(shuō)明FepB蛋白可能與ViuP蛋白來(lái)源于同一個(gè)進(jìn)化的家族,而不是目前已經(jīng)報(bào)道的其他的鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族； 3)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的一個(gè)重要特征是FepB蛋白與帶鐵腸菌素分子是以3：4的比例結(jié)合,每三個(gè)結(jié)合了腸菌素分子的FepB蛋白中間還結(jié)合了一個(gè)額外的帶鐵腸菌素分子,這種結(jié)合比例模式在其他鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中從未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)對(duì)加入不同濃度腸菌素分子的FepB蛋白溶液的動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)高濃度的帶鐵腸菌素分子能夠使FepB蛋白的聚合態(tài)由單體轉(zhuǎn)變?yōu)槿w,據(jù)此我們推測(cè),FepB蛋白除了具有轉(zhuǎn)運(yùn)腸菌素的作用,可能還具有儲(chǔ)存帶鐵腸菌素的功能,從而防止冗余的帶鐵腸菌素分子通過(guò)TolC系統(tǒng)溢出,提高了大腸桿菌對(duì)腸菌素分子的利用率； 4)通過(guò)序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)疊合我們找到了FepB蛋白上可能與下游FepDG蛋白作用的兩個(gè)保守的酸性氨基酸殘基Glu-109和Glu-251。在驗(yàn)證這兩個(gè)氨基酸殘基的重要性時(shí)我們發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)氨基酸的重要程度并不一致。Glu-251氨基酸突變掉之后,回補(bǔ)的fepB敲除的大腸桿菌在限鐵LB平板上不能正常生長(zhǎng),而Glu-109氨基酸突變掉之后,回補(bǔ)的fepB敲除的大腸桿菌卻依然能夠正常生長(zhǎng)�？赡苁怯捎贕lu-251突變掉之后FepB蛋白不能識(shí)別下游的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,而FepB蛋白的Glu-109突變體依然能夠識(shí)別下游ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并將帶鐵腸菌素傳遞下去,這說(shuō)明在識(shí)別下游ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過(guò)程中,FepB蛋白的C端結(jié)構(gòu)域可能發(fā)揮了更重要的作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R37

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2574558