【摘要】：睪丸局部溫和的熱刺激可引起可逆的生精障礙,以往研究表明熱作用可能是通過引起生精細(xì)胞凋亡而致生精破壞。近年來研究發(fā)現(xiàn),在體細(xì)胞中熱作用也可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。自噬是一個(gè)降解壞死細(xì)胞器及變性蛋白質(zhì)的過程,在促進(jìn)細(xì)胞存活,維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),保持細(xì)胞健康過程中起著重要作用。同時(shí)自噬也可以引起細(xì)胞死亡,稱為自噬性細(xì)胞死亡,是程序性細(xì)胞死亡的一種。在細(xì)胞死亡的過程中自噬與凋亡的關(guān)系非常復(fù)雜,目前尚未能完全闡明。自噬在生精細(xì)胞中的發(fā)生及作用目前尚沒有報(bào)道。本研究試圖揭示熱作用是否也誘導(dǎo)生精細(xì)胞中自噬的發(fā)生,以及這個(gè)過程是否參與了熱所致的生精破壞過程。對(duì)上述問題的闡述能幫助我們進(jìn)一步理解精子發(fā)生的分子調(diào)控機(jī)制。 我們運(yùn)用小鼠作為研究模型,分別從體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)兩方面進(jìn)行了研究。首先探討熱作用后生精細(xì)胞的自噬和凋亡狀態(tài)。我們構(gòu)建了小鼠睪丸局部受熱模型,將小鼠行睪丸局部42℃的水浴受熱15分鐘,受熱后恢復(fù)的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞凋亡和自噬水平檢測(cè),結(jié)果顯示:受熱后12小時(shí),生精細(xì)胞的凋亡和自噬水平均顯著增加。另一方面,我們對(duì)小鼠精母細(xì)胞系(GC2-spd細(xì)胞)行42℃孵育受熱3小時(shí),構(gòu)建了體外生精細(xì)胞受熱模型,結(jié)果顯示熱作用后GC2-spd細(xì)胞的自噬和凋亡水平也顯著升高。上述結(jié)果提示熱作用能誘導(dǎo)生精細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬。 進(jìn)一步我們?cè)噲D揭示經(jīng)典的泛素樣蛋白通路(ubiquitin-like conjugation pathway)是否參與熱所致的小鼠生精細(xì)胞自噬過程,從以下三個(gè)方面進(jìn)行了研究:(1)檢測(cè)參與泛素樣蛋白通路的相關(guān)基因/蛋白在小鼠睪丸中的表達(dá)情況。ATG(Autophagy-related)基因是最先在酵母鑒定出的一組自噬相關(guān)基因,其中Atg12-Atg5和Atg8(LC3)-PE(磷脂酰乙醇胺)是介導(dǎo)自噬泡正常形成的兩條泛素樣蛋白通路,本研究運(yùn)用RT-PCR手段從mRNA水平證實(shí)這兩條通路中所有基因在小鼠睪丸均有表達(dá);而Western Blot檢測(cè)顯示通路中的關(guān)鍵上游蛋白Atg7在間質(zhì)細(xì)胞,支持細(xì)胞以及各級(jí)生精細(xì)胞中均有表達(dá)。上述結(jié)果提示泛素樣蛋白通路可能在熱作用誘導(dǎo)的生精細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮作用。(2)選取泛素樣蛋白通路中的關(guān)鍵蛋白Atg7作為研究靶點(diǎn),檢測(cè)該蛋白的表達(dá)是否與熱所致的生精細(xì)胞自噬相關(guān)。結(jié)果顯示:睪丸局部受熱及體外精母細(xì)胞系受熱后,Atg7的表達(dá)水平升高,并在受熱后12小時(shí)達(dá)到高峰,這與受熱后自噬水平增加的趨勢(shì)相一致。提示Atg7及其參與的泛素樣蛋白通路可能參與了熱作用誘導(dǎo)的生精細(xì)胞自噬過程。(3)通過干涉Atg7的表達(dá)抑制泛素樣蛋白通路的作用,檢測(cè)其對(duì)熱誘導(dǎo)自噬的影響。我們用RNAi的手段分別在小鼠睪丸和GC2-spd細(xì)胞中抑制了Atg7的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Atg7表達(dá)下調(diào)后能顯著降低熱所致的生精細(xì)胞的自噬水平。這一結(jié)果更直接地揭示Atg7及其參與的泛素樣蛋白通路介導(dǎo)了熱作用誘導(dǎo)的生精細(xì)胞自噬。 最后我們探討了Atg7及其參與的自噬在熱致生精障礙中的作用。在小鼠睪丸和GC2-spd細(xì)胞中用RNAi的手段抑制Atg7的表達(dá),加熱后分別用TUNEL及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果顯示:當(dāng)Atg7表達(dá)下調(diào)而抑制了自噬的發(fā)生后,生精細(xì)胞的凋亡也顯著下降。這一結(jié)果提示,熱作用后,Atg7及其參與的自噬可能參與到生精細(xì)胞的凋亡進(jìn)程,共同引起生精障礙。 綜上所述,本研究證實(shí)熱作用可以誘導(dǎo)小鼠生精細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬,這兩者可能以協(xié)同作用參與到細(xì)胞死亡進(jìn)程中,從而引起生精障礙。而Atg7及其參與的泛素樣蛋白通路可能是熱誘導(dǎo)自噬發(fā)生的主要通路。
【圖文】：

1：熱刺激誘導(dǎo)小鼠睪丸中生精細(xì)胞凋亡。A 圖：運(yùn)用 TUNEL 染色的方法，檢測(cè)正常及受熱后 30 分鐘，2 小時(shí)，6 小時(shí)，12 小時(shí)，2 天的小鼠睪丸中凋亡的細(xì)胞，結(jié)果顯熱后 30 分鐘，睪丸中凋亡的細(xì)胞開始增加，20×（單位長度=50μm）。B 圖：受熱后時(shí)睪丸生精細(xì)胞凋亡率與未受熱相比顯著增加。細(xì)胞凋亡率為一個(gè)切面中所有凋亡細(xì)/所有管腔數(shù)，n=3，*：與未受熱組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.05。

誘導(dǎo)小鼠睪丸生精細(xì)胞發(fā)生自噬。A 圖：運(yùn)用 Western Blot 的方法30 分鐘，2 小時(shí)，6 小時(shí)，12 小時(shí)，2 天的小鼠睪丸中 LC3 水平，，，12 小時(shí)以及 2 天時(shí)，小鼠睪丸的 LC3-I 向 LC3-II 轉(zhuǎn)化增加。B 圖時(shí)以及 2 天時(shí)，小鼠睪丸的 LC3-II/LC3-I 顯著升高，n=3，*：與未學(xué)意義，p＜0.05。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R363

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 錢帥偉;運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌氧化應(yīng)激及自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響[D];華東師范大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2574310